γ-氨基丁酸能神经元在新生大鼠缺氧性痫性发作中的作用

孙卫文， 詹丽璇， 李 珂， 徐 恩

缺氧是导致新生儿缺氧性脑病和痫性发作的主要原因。新生儿缺氧在临床上极为常见。相对于正常儿童、新生儿期或围产期缺氧的患儿成年后对致痫因素的敏感性升高［1］。目前尚未明确新生儿期的缺氧性损害是如何导致成年后癫痫易感性升高的。本研究通过建立新生大鼠缺氧性痫性发作模型，观察新生大鼠早期发育过程中及缺氧性痫性发作后海马的组织病理改变，探讨原癌基因c-fos与γ-氨基丁酸(γamino butylic acid，GABA)能神经元在新生大鼠缺氧性痫性发作模型中的作用及可能的影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新生10d的SD大鼠，由中山大学医学院实验动物中心提供，置于光照:黑暗=12:12标准光照周期的动物房喂养，母鼠与同窝小鼠同笼饲养，母鼠自由摄食和饮水。所有实验动物的操作及饲养均符合中华人民共和国实验动物管理条例。

1.2 动物分组 实验动物分为对照组(C)和缺氧性痫性发作组(H)。根据不同时间点，对照组又分为:对照1d组(C1d)、对照3d组(C3d)、对照7d组(C7d)、对照14d组(C14d)。缺氧性痫性发作组分为缺氧后1d组(H1d)、缺氧后3d组(H3d)、缺氧后7d组(H7d)、缺氧后14d组(H14d)。每组10只动物。

1.3 主要实验试剂 混合气体购自广州市气体场，S-P试剂盒购自迈新生物技术开发有限公司;抗GAD抗体购自Stressgen Bioreagents;抗c-fos抗体购自Santa Cruz Biotechnology。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物模型的制备 本研究采用改良的新生大鼠缺氧性痫性发作模型［2］，选取新生10d的Sprague-Dawley(SD)大鼠为实验对象，在恒温34℃的缺氧箱内进行缺氧，通入恒温34℃的含有5%氧气、95%氮气的混和气体，共通气17min。通气17min后取出新生鼠，做标记后放入原笼中，与其母鼠一同喂养。

1.4.2 动物模型成功标准 动物在进行缺氧的17min内出现面部痉挛、节律点头、跌倒等表现。根据经典的Racine标准［3］对动物表现进行分级:0级:无惊厥;1级:面部痉挛;2级:面部痉挛+节律点头;3级:面部痉挛+节律点头+前肢阵挛;4级:面部痉挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立;5级:面部痉挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒。4、5级为全身性惊厥或大发作，为入组标准。舍去标准:明显体弱，不能自食母乳的新生鼠;缺氧过程中死亡的新生鼠;缺氧过程中表现未达到4级或以上的新生鼠。缺氧后将新生鼠放入置有其同胞新生鼠及母鼠的笼内，注意保暖，注意保持笼内卫生。

1.4.3 脑组织取材 麻醉动物后用4℃生理盐水100ml经心脏快速灌注冲净血液，随后用4℃的4%的多聚甲醛以先快后慢的速度灌注固定。取脑放入4℃的4%的多聚甲醛中进行后固定，并先后放入15%、30%的梯度蔗糖多聚甲醛溶液中脱水，冰冻包埋剂包埋，冰冻切片(片厚40μm)，选取典型海马区脑片，一部分用于做Nissl染色，光镜下观察脑缺氧损伤组织学特点，另一部分做免疫组织化学，观察GAD和c-fos在不同时间段正常新生大鼠海马组织的表达及脑缺氧性痫性发作后不同时间段的变化。

1.4.4 Nissl染色 脑片1%焦油紫溶液染色15min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。

1.4.5 免疫组织化学SP法染色 脑片放入装有0.01mol的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 值 7.4)的多孔板，PBS洗3次各5min，3%H2O2室温孵30min，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗3次各5min，加入由PBS稀释的混合溶液，溶液含第一抗体(GAD 1:800或者c-fos 1:800)、封闭液(2%小牛血清，0.1%Triton)，4℃震荡孵育过夜。PBS洗3次各5min，滴加含生物素标记的第二抗体，室温孵育2h。PBS洗3次各5min，滴加含辣根过氧化物酶标记的第三抗体，室温孵30min。PBS洗3次各5min，DAB显色液显色1min。梯度酒精脱水，透明，封片。

1.5 数据采集 对于DAB免疫组化的结果进行阳性细胞计数，每张切片于CA1区选5个高倍镜视野，分别计数阳性细胞数，取均值进行统计分析。c-fos免疫组化的结果用WCIF Image J系统分析，每只动物均随机挑选1～2张典型背测海马切片，低倍镜下读取海马CA1区的灰度值，选取胼胝体作为背景，将背景的灰度值减去CA1区的灰度值进行统计分析。

1.6 统计分析 采用SPSS11.5进行统计分析。多组数据之间计量资料的比较用单因素方差分析(ONE WAY ANOVA)，组间的数据两两比较采用Bonferreoni或者Tamhane’s T2检验。两组数据的计量资料用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠海马各区域Nissl染色结果 对照组及缺氧组大鼠脑组织低倍镜下海马各区细胞排列紧密，形态结构正常;高倍镜下神经元结构完整，细胞内有丰富粗大的尼氏体。缺氧组中海马各区域细胞结构完整，胞浆内尼氏体无明显改变，未见细胞死亡。

2.2 大鼠海马各区域c-fos免疫组织化学反应的结果 对照组和缺氧性痫性发作组的海马各区均可见棕黄色c-fos蛋白免疫阳性细胞，细胞呈圆形或椭圆形，c-fos主要均匀分布于胞核，胞核着色最深(见表1)。各组c-fos蛋白灰度分析如表1所示。单因素方差分析显示各对照组海马CA1区c-fos蛋白灰度值差异无统计学意义(F=0.441，P=0.727);CA3区c-fos蛋白灰度值差异无统计学意义(F=0.477，P=0.703);DG 区域 c-fos 蛋白灰度值差异无统计学意义(F=0.338，P=0.798)。单因素方差分析显示各缺氧性痫性发作组CA1区c-fos蛋白灰度值差异有非常显著意义(F=56.21，P＜0.01)，组间比较显示H7d组c-fos蛋白灰度值明显高于 H1d组、H3d组和 H14d组 (P＜0.01，P＜0.01，P ＜0.01)，H1d 组、H3d组与 H14d组间 c-fos蛋白灰度差异无统计学差异;CA3区(F=186.91，P＜ ＜0.01)和 DG 区(F=34.39，P ＜ 0.01)结果与CA1区相似，H7d组c-fos蛋白灰度值明显高于其它时间点组。各缺氧性痫性发作组与对照组海马CA1区域c-fos蛋白灰度分析的比较，单因素方差分析显示各缺氧性痫性发作组与各对照组CA1区域c-fos蛋白灰度值差异有非常显著意义(F=41.91，P＜0.01)。组间比较显示H7D组的c-fos蛋白灰度值明显高于C7d组(P＜0.01)，而H1d组与C1d组间(P=0.264)、H3d 组与 C3d 组间(P=0.498)、H14d组与C14d组间(P=0.637)c-fos蛋白灰度差异无统计学意义。CA3区(F=127.9，P ＜0.01)和 DG 区 F=30.62，P ＜0.01)结果与 CA1区相似，缺氧性痫性发作7d组c-fos蛋白灰度值明显高于对照7d组，其它各组间比较差异无统计学意义。

2.3 大鼠海马各区域DAB免疫组织化学反应的结果 缺氧性痫性发作组和对照组各海马分区均可见棕褐色GAD蛋白免疫阳性细胞。GAD蛋白免疫阳性细胞弥散地分布在整个海马结构。阳性细胞主要密集地排列在CA1～CA3的锥体细胞层和齿状回的颗粒细胞层，大部分为卵圆形或多边形，部分神经元的突起清晰可见。阳性细胞在CA1区主要分布在起层(stratum orients，SO)和锥体细胞层(stratum pyramidale，SP)，而在 CA1～CA3区锥体细胞层则可以看到GAD免疫反应阳性的轴突丛，可见有部分神经元的突起贯穿整个锥体细胞层。各组GAD阳性细胞数(见表2)。

表1 各组c-fos蛋白灰度分析的比较(χ±s)

表2 各组GAD阳性细胞数的比较(χ±s)

3 讨论

缺氧造成的癫痫样发作多发生于儿童［4］。围产期缺氧造成的急性癫痫样发作能使患儿在发育过程中对癫痫的易感性升高，并能造成患儿长时期的智能受损。故新生鼠缺氧性癫痫模型是人们研究脑缺氧的理想方法之一。Jensen［2］等研究发现缺氧的致痫作用具有明显的时间依赖性，相对于新生5d鼠或成年鼠(出生后60d)，新生10～12d的大鼠对缺氧特别敏感。新生10～12d大鼠缺氧时的强直阵挛发作、缺氧后对致痫因素的敏感性升高及发育成熟后的智能受损，这些表现均与临床新生儿缺氧性癫痫症状极为相似。本研究采用Jensen改良新生大鼠缺氧性痫性发作模型，在缺氧过程中根据经典的Racine标准对动物表现进行分级。本实验结果显示Jensen改良新生大鼠缺氧性痫性发作模型缺氧时强直性阵挛发作表现较一致，重复性好，除极个别大鼠评分未达到4级外，绝大部分大鼠达到4级、5级评分，符合全身性惊厥或大发作的入组标准。

Jensen［2］等用含有 3%O2的混合气体对新生10d大鼠进行缺氧，并将其在缺氧后75d暴露于致痫剂三氟乙醚，2～3d后取鼠脑进行HE染色，结果显示未见神经胶质细胞增生，皮层、杏仁核、海马、齿状回均正常。Sanchez［5］等 通过原位末端标记法对改良后的新生大鼠缺氧性痫性发作模型进行了形态学观察，选取缺氧后 12h、24h、48h、72h、96h 和 7d 各个时间点进行观察，结果显示，没有在海马区域发现受损或濒死的细胞。本研究显示新生大鼠缺氧性痫性发作模型未能造成缺氧后即时或缺氧后14d内海马明显的细胞死亡，与上述研究结果一致。结果表明，新生大鼠低氧后痫性发作并非由于神经元丢失所致。然而，Garrido［6］在对毛果云香碱诱发的癫痫持续状态模型的研究中发现癫痫发作一个月后基底前脑中间区和外侧区出现明显萎缩。对于缺氧14d后的时间点海马区域和其它脑区的组织病理学改变尚需进一步研究证实。

c-fos是神经功能活动的代谢性标志物，属于即早基因为细胞受刺激后表达的基因。正常情况下，细胞内c-fos的mRNA和c-fos蛋白水平均很低，缺氧、炎症等损伤性刺激因子可诱导中枢神经系统内c-fos基因的表达。缺氧后大量内流的Ca2+激活cfos基因的转录和翻译。Szyndler［7］等研究发现，戊四唑化学点燃癫痫样活动能够使大鼠齿状回、梨状皮层细胞核内的c-fos蛋白免疫反应活性快速而短暂地增强。Gass［8］等在用GABA能受体抑制剂荷包牡丹碱(bicuculline)静脉注射诱发大鼠癫痫发作后，发现c-fos蛋白在海马区表达迅速增高，2h达高峰，8h恢复至基础水平，其表达主要位于齿状回颗粒细胞层。以上研究证明，当神经元受刺激后，c-fos的表达快速出现，迅速达到高峰，维持较短时间后又回到基础稳定水平。但也有学者持不同的意见，Liang等［9］在破伤风毒素(tetanus toxin，TT)所致 SD 大鼠癫痫模型中发现，同为IEGs的Zif/268蛋白质在TT注射5～7d后出现表达增强，持续14d。有学者提出c-fos的表达至少存在3种模式:(1)快速一过性表达;(2)延迟持续性表达;(3)持续的组织特异性表达［10］。本研究结果显示缺氧7d后c-fos蛋白含量在海马各区的表达明显增加，表明缺氧性痫性发作后存在c-fos的延迟性表达，其表达的增加可能起始于缺氧后4～7d，到缺氧后14d时已降低到基础水平。Taniguchi［11］等的研究表明缺氧后即出现c-fos表达的增高，3h后降到对照组水平，1d后出现c-fos的第二次增高，7d时到达最高值，与本实验结果一致。cfos本身的变化不可能在各种刺激发生后出现持久的功能和行为改变中起重要作用，但是c-fos的表达产物可以与目标基因的起动子区域相结合，作为转录因子来调节这些基因的表达，从而对细胞的结构、功能产生长期影响。本研究中缺氧后7d c-fos表达的增高是否与缺氧性脑病痫性发作后神经元的损伤与修复有关将有待进一步研究探讨。

GABA是哺乳动物中枢神经系统中起主要作用的抑制性神经递质，GAD表达异常可引起GABA的水平的异常。有研究显示海马区域的GAD蛋白最早出现在胚胎发育的第17～18天，胚胎期GAD mRNA水平与成年期相比存在明显的差异［12］。Seress［13］等的研究发现海马区GAD阳性神经元的增加在发育过程中存在两个高峰，第一个高峰是在出生后4～8d;第二个高峰是在出生后12～16d。本研究结果显示GAD蛋白的含量随着发育的进行呈进行性增高的趋势，且出生后13d左右升高最明显，提示起始于海马发育早期的GABA能神经元在大鼠出生初期并未成熟，而是随个体的发育数量逐渐增加、功能渐趋完善。

多年来，学者们一直认为中枢神经系统内GABA能神经元抑制作用减弱或缺乏是导致兴奋性毒性损害发生的重要原因之一。然而近年来的研究却发现在新生儿发育过程中存在着Cl-从神经元细胞内向细胞外转移现象［14］，中枢神经系统神经元内的低Cl-浓度状态是由神经系统发育初期的高Cl-浓度状态转变而来，而抑制性GABA能神经元在胚胎发育初期则发挥兴奋性神经元的作用［15］。关于GABA能神经元功能转变时间，大部分学者认为在新生后2w左右［16］。本研究选用新生10d大鼠制作模型，此期间GABA应是起兴奋性毒性损害作用，然而本研究的结果却显示缺氧后3d内GAD表达与对照组相比无明显改变，提示GABA能神经元在新生大鼠缺氧性痫性发作后早期并没有发挥明显的兴奋性损害或抑制性保护作用。Koh［17］的研究发现缺氧对新生10d大鼠造成的急性和慢性作用均能被谷氨酸AMPA受体抑制剂所阻滞。Azimi-Zonooz等［18］研究发现新生7～13d大鼠海马区域Ca2+内流主要是由谷氨酸能神经元激活导致的，而GABA能神经元的激活对Ca2+内流的影响作用却甚微。由此我们推测在新生大鼠缺氧性痫性发作早期中发挥主要作用的神经元仍是传统意义上的兴奋性神经元-谷氨酸能神经元。

本研究结果显示在海马的CA1区、CA3区以及DG区，缺氧后7～14d GABA能神经元的含量减少，提示缺氧性痫性发作后在海马的CA1区、CA3区以及DG区存在着GABA能神经元的损伤过程。目前已有多种癫痫模型显示有GABA能神经元的丢失。Freichel［19］等发现在红藻氨酸或毛果云香碱诱发的癫痫发作后，大鼠梨状皮质 GAD含量降低。Thind［20］等发现在毛果云香碱诱导的癫痫模型中大鼠海马齿状回区出现GABA能神经元早期即出现的丢失。Guo［21］等在对毛果云香碱诱发的癫痫模型研究中，也发现在癫痫发作后海马齿状回区出现了含GAD(67)mRNA的神经元的大量丢失。本研究中GABA能神经元的丢失是否与成年后癫痫易感性升高有关尚需进一步研究证实。目前尚不清楚GABA能神经元在癫痫模型中丢失的机制，但已有研究发现在癫痫模型中出现含有钙结合蛋白的神经元的大范围丢失［22］。目前国内外学者普遍认为短暂快速的Ca2+内流和缓慢的Ca2+内流引起的细胞去极化是导致这种自发性放电的重要原因之一，当去极化达到一定程度时，就会爆发一系列迅速的去极化过程。钙结合蛋白是一类能与Ca2+结合的蛋白质，存在于包括神经元在内的多种细胞，钙结合蛋白可以保护神经元免遭由于电压依赖性钙浓度过高引起的损害，而含钙结合蛋白的神经元则能够对癫痫发作中的细胞内Ca2+超载起到一定的缓冲保护作用。Magloczky［23］等对10例颞叶癫痫患者的颞叶切片研究中发现4名患者的齿状回颗粒细胞钙结合蛋白的丢失率超过90%，4名患者的齿状回颗粒细胞钙结合蛋白的丢失率超过50%，2名患者的丢失率为20%。有学者推测由钙结合蛋白的功能受损发展到GABA能中间神经元的丢失是癫痫的主要病理过程。本研究未涉及缺氧性痫性发作模型中GABA能神经元丢失的具体机制，其是否与钙结合蛋白的损伤有关有待进一步研究探讨。

本研究的结果显示，缺氧性痫性发作后14d内并没有造成大鼠海马区即时或迟发性细胞丢失，但c-fos表达在大鼠海马区有迟发性增高;缺氧性痫性发作后海马GABA神经元数量的减少可能是新生大鼠缺氧诱导痫性发作后癫痫易感性升高的原因之一。

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