镉胁迫对滇润楠幼苗生理特性的影响

姜永雷，鲁红鼎，邓莉兰，黄晓霞

(西南林业大学 园林学院 昆明 650224)

重金属污染的问题现在越来越严重。每年都会有很多的重金属通过工业“三废”被排放到土壤或者空气中，严重影响了人们的生活质量。其中镉是一种毒性很强且污染较严重的重金属，虽然不是植物生长所必需的营养元素但是很容易被植物吸收并积累，导致植物的生理和品质显著下降，严重影响植物正常的生长发育［1］。有研究表明，镉离子(Cd2+)胁迫能够抑制PSII捕光复合体(LHCII)捕获光能的能力和降低电能激发的效率［2］。另外镉胁迫对植物的叶绿素含量、PSII的酶活性、电子的传递途径及光能的吸收和固定都有抑制作用［3－5］。镉离子还可以影响植物的生长、水分的吸收和呼吸作用，但是植物对Cd2+的胁迫可以通过提高抗氧化酶系统的活性、体内可溶性蛋白和脯氨酸的含量来提高抗性［6］。

滇润楠(Machilus yunnanensis)通称为香叶粉，为樟科(Lauraceae)润楠属(Machilus)的常绿乔木，高达20 m以上，主要分布在云南中部，西部至西北部，四川西南部和西部等地区，由于其生长较快，树形优美，对污染有一定的抵抗力，在改善环境和提高居民生活方面有很大的作用。在云南地区是很好的园林绿化树种，在昆明城市园林绿化规划中已经被作为乡土树种应用，并入选为昆明市民最喜爱的10种园林绿化树种之一。目前国内外对滇润楠的研究主要集中在观赏、组织培养、快速繁殖和光合速率等方面［7－8］，而对其耐重金属胁迫的研究较少，叶绿素荧光参数的变化能够反映植物在重金属胁迫中的生长状况［9］。叶绿素荧光动力学参数在植物的抗逆性［10］、生态性［11］和作物育种［12］等方面都得到了广泛的应用。该试验以滇润楠实生幼苗为材料，通过测定Cd2+胁迫下植株的荧光参数和生理特性的变化，研究该树种对Cd2+胁迫的适应性，可为滇润楠的栽培及园林应用提供理论依据和科学指导，对于扩大种植云南乡土树种有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试验处理

1.1.1 试验材料与试验设计 选取健康并生长一致的滇润楠两年生实生苗，于2012年8月中旬移栽到5 L塑料盆中，基质为红土+珍珠岩+腐殖土(3∶3∶2)的混合基质。本试验共设3个组(对照CK)，Cd2+处理A组，Cd2+处理B组。试验大棚内白天温度范围为20～30℃，夜间温度范围为9～18℃，相对湿度为35%～80%。处理时间从2012年9月中旬到10月中旬，共一个月时间。所有指标测定在处理结束时进行，每株选取从上到下的第3至第5片完全展开的叶作为荧光参数及生理生化指标的测定样品，每处理至少5株重复。

镉胁迫处理:分别用10 mmol/L CdCl2溶液(Cd2+A组)和20 mmol/L CdCl2溶液(Cd2+B组)进行处理，每处理组10盆，每盆1株，每株隔天均匀浇灌10 mL处理溶液，对照组用清水代替，再补充至水分充足。

1.1.2 叶绿素荧光参数的测定 用调制叶绿素Imaging－PAM M－series调制叶绿素荧光成像系统(德国WALZ公司)测定叶绿素荧光参数。植物材料经充分暗适应后，先用测量光(0.5 μmol/(m2·s)测定初始荧光F0，饱和光脉冲2 700 μmol/(m2·s)(脉冲时间0.8 s)诱导Fm，作用光强度为186 μmol/(m2·s)。将待测叶片置于样品台上，选定多个直径1 cm的AOI后，在软件的Kinetics窗口检测各叶绿素荧光参数的动力学变化曲线，相应数据直接从Report窗口导出。每处理至少5个重复。叶片初始荧光(F0)、反应中心PS II潜在最大光合效率(Fv/Fm)、PS II实际光合效率(Yield)、荧光淬灭(qP)、非光化学淬灭(qN)等参数的计算，由仪器自动给出。

1.1.3 其他生理指标测定 丙二醛MDA含量测定参照Hodges等［13］。

抗氧化酶活性的测定:取0.2 g叶片材料于5 mL提取缓冲溶液(50 mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液，pH 7.0，含1 mmol/L EDTA，0.05%(V/V)Triton X －100，2%(W/V)不溶性聚乙烯吡咯烷酮)中研磨成匀浆。经过10 000×g离心20 min，取上清液进行酶活性测定。过氧化物酶(POD，EC 1.11.1.7)活性测定:参考Lin and Wang［14］的方法，用愈创木酚被H2O2氧化来测定POD酶活。根据消光系数(26.6 mmol/(L·cm))，计算酶活性。超氧化物岐化酶(SOD，EC 1.15.1.1)活性测定:参照 Giannopolitis等［15］的方法，利用SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下被O2还原的反应，在波长560 nm处，检测吸光光度值。SOD活性以每mg蛋白抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位(U)。

可溶性蛋白含量测定参照Bradford［16］的方法。

游离脯氨酸含量测定参照Bates等［17］的方法。

叶绿素含量测定:参照Inskeep等［18］的方法，称取0.1 g植物叶片，用冷的二甲基甲酰胺暗中4℃下浸提48 h，于663.8和646.8 nm下比色。计算单位叶鲜重的叶绿素a、叶绿素b含量。

1.2 统计分析

所有的数据分析都利用SPSS 11.5统计分析软件进行一元方差分析(one－way ANOVA)，平均数间的多重比较采用Ducan＇s检验方法。P＜0.05时差异显著。

2 结果与分析

2.1 Cd2+处理对叶绿素荧光参数的影响

如表1所示，与对照(CK)相比，Cd2+处理下的滇润楠幼苗叶片初始荧光 F0显著上升，且在10 mmol/L的Cd2+处理浓度下F0值最高。此外，不同浓度Cd2+处理后，滇润楠幼苗叶片的最大光化学效率(Fv/Fm)和实际光合效率(Yield)均显著下降，其值都远远低于对照组，但不同浓度处理组之间差异不显著。说明重金属Cd2+胁迫使得PSII反应中心受到损伤，其实际原初光能捕获效率及光能转换效率都降低，叶片的光合能力受到抑制。非光化学猝灭系数(qN)及光化学猝灭系数(qP)的变化如表1所示，与对照组相比，Cd2+胁迫下滇润楠幼苗qN值有所增加，但并不显著，而qP值变化不明显。说明在胁迫下该树种会倾向于将更多的能量用于热耗散，对光合器官起到保护作用。

表1 Cd2+处理对叶绿素荧光参数的影响Tab.1 Effect of Cd2+on Chlorophyll fluorescence parameters

2.2 Cd2+处理对叶绿素含量的影响

由表2可以看出:与对照(CK)相比，Cd2+胁迫下的滇润楠幼苗叶片Chla和Chlb均显著降低，且在10 mmol/L和20 mmol/L溶液处理组中叶绿素a的下降率分别为18.6%和43.6%;叶绿素b的下降率分别为13.7%和39%。由此可以看出叶绿素b的下降比例小于叶绿素a，而使得Chl b/a比值增加。

表2 Cd2+处理对对叶绿素含量的影响Tab.2 Effect of Cd2+on Chlorophyll content

2.3 Cd2+处理对滇润楠叶片MDA含量的影响

丙二醛(MDA)是膜上不饱和脂肪酸发生一系列活性氧反应的产物，膜脂过氧化的强弱可以通过MDA含量来判断，MDA含量越高其膜脂过氧化程度越高。试验结果可看出，无论是在低浓度还是高浓度Cd2+处理组中，植株叶片中的丙二醛(MDA)含量与对照相比都显著增加(图1)。且随着Cd2+浓度的增加，MDA的含量增加幅度越大，说明在高浓度的Cd2+处理下，滇润楠幼苗受到的膜质过氧化伤害程度更大。

图1 Cd2+处理对丙二醛(MDA)含量的影响Fig.1 Effect of Cd2+on MDA content

图2 Cd2+处理对抗氧化酶SOD和POD活性的影响Effect of Cd2+on antioxidative enzyme(SOD)and(POD)activities

2.4 Cd2+处理对滇润楠叶片可溶性蛋白及脯氨酸含量的影响

由表3可以看出，在受到Cd2+胁迫时，植株体内的可溶性蛋白含量呈显著下降趋势，在Cd2+A和Cd2+B处理间差异显著，与对照组相比，其含量分别降低了34.1%和28.9%。脯氨酸是重要的渗透调节物质，在植物响应逆境过程中起着重要作用。本试验中，Cd2+处理下的植株叶片内脯氨酸含量显著上升(表3)，且Cd2+B处理组下脯氨酸含量超过了对照组(CK)的一倍以上。表明滇润楠幼苗在遭受Cd2+胁迫时，可通过自身脯氨酸的累积来提高细胞的渗透势，进行渗透调节，减小逆境胁迫下细胞组织的失水。

表3 Cd2+处理对叶片可溶性蛋白和脯氨酸含量影响Tab.3 Effect of Cd2+on soluble protein and proline contents

2.5 Cd2+处理对滇润楠叶片抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是植物应对逆境伤害的重要的抗氧化酶类。Cd2+处理对滇润楠幼苗的两种抗氧化酶活性影响显著(图2)。与对照相比，SOD在Cd2+的处理下表现出下降趋势。说明在Cd2+处理下SOD并未起到很好的其抗氧化的作用。而过氧化物酶(POD)随着Cd2+浓度的增大呈显著性上升，与对照相比，在Cd2+的浓度为10 mmol/L和20 mmol/L时分别增加了42.4%和54.5%。说明滇润楠幼苗可以通过提高过氧化物酶(POD)的活性来应对Cd2+的胁迫。

3 结论与讨论

本研究中，所测的13个生理生化指标中，有9个指标都表现出受Cd2+影响的显著效应。试验结果表明氯化镉溶液处理下滇润楠幼苗的光合系统及其他生理生化性状都受到了一定程度的伤害，且随着镉离子处理浓度的增加其伤害程度加深;另一方面，镉离子的胁迫亦可激发滇润楠幼苗启动抗氧化酶系统及渗透调节系统来减轻不良环境下的伤害。综合所测指标分析，滇润楠能够抵御低浓度的Cd2+胁迫对其造成的伤害，而高浓度的Cd2+胁迫超过了滇润楠幼苗的抵御范围，对该幼苗的伤害程度较大。

叶绿素荧光与光合作用各个反应过程紧密相关，任何逆境胁迫对光合作用产生的影响都可以通过叶绿素荧光诱导动力学参数的变化反映出来。植物的初始荧光F0与PSII反应中心活性有关，是评价植物逆境伤害的一个重要指标［19］。本试验结果表明，Cd2+处理下的滇润楠幼苗叶片初始荧光F0显著上升，这与钱永强等［20］的“随着镉离子处理浓度的增加，银芽柳叶片的初始荧光F0显著增加”的研究结果一致，说明在镉胁迫下叶片PSII反应中心活性被破坏，导致初始荧光值上升。Fv/Fm反映PSII反应中心内禀光能转化率，在正常情况下该参数变化很小，不受物种和生长条件的影响［2］。该试验中Cd2+处理下滇润楠幼苗Fv/Fm显著下降，相似结果在Baszynski et al.［3］对番茄幼苗的研究中也有过报道，认为是PSII的反应中心活性受到了Cd2+胁迫的影响，使叶片的光合能力降低，抑制了光合电子链的传递速率。实际光合效率(Yield)反映PSII反应中心在部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率。Qin et al.［21］的研究证明，过量的Cd2+胁迫会降低光合电子传递效率，从而降低Yield的转化比例。本试验结果表明，不同Cd2+浓度处理下的幼苗叶片Yield值显著降低。其结果与姚广等［5］、万雪琴等［10］的研究结果一致，说明PSII反应中心受到了一定程度的伤害。虽然非光化学猝灭系数(qN)及光化学淬灭系数(qP)在本研究中变化并不显著，但与对照组相比，qN值的轻微增加也说明了滇润楠幼苗在Cd2+胁迫下有增加热耗散的趋势而避免逆境下的光抑制现象，而qP值在不同处理组中则相对稳定，可能是PSII反应中心的开放比例没有受到太大的影响。

光合作用是植物生长的重要能量来源和物质基础，叶绿素是绿色植物体内的基本色素，在光合作用的光能吸收、传递和转化中起着不可或缺的作用，其含量的多少对光合速率有直接的影响。本试验中，Cd2+胁迫下，光合色素含量与对照组相比呈下降趋势，且在高浓度Cd2+处理组中表现出显著效应，说明Cd2+胁迫将破坏或抑制叶绿素的合成，这在王春梅［22］对茶树的研究中有过类似报道。Chl(a/b)的比值代表着类囊体的垛叠程度，其值越低，意味着类囊体的垛叠程度越小，光抑制越强［23］。本研究中，Cd2+胁迫下叶绿素b/a的比值呈上升趋势，说明在镉胁迫下滇润楠幼苗叶片类囊体的垛叠程度减小，更容易发生光抑制。

MDA是脂质过氧化产物之一，其含量高低可以反映植物遭受逆境伤害的程度，含量越高其遭受到的伤害越大［24］。本研究中，MDA的含量随着Cd2+浓度的增加呈显著增加趋势。这在前人的研究中有过相似的结果报道［25－26］，说明在Cd2+胁迫下，细胞膜脂过氧化严重，植株的正常代谢受到影响。脯氨酸(Pro)是细胞内重要的渗透调节物质，具有调节细胞渗透平衡、增强细胞结构稳定性及阻止超氧自由基产生的作用，它与植物体内活性氧自由基的清除以及膜脂过氧化作用的减轻密切相关［27］，从本研究结果中可以看出，脯氨酸在Cd2+胁迫下含量显著增加，这与李清飞等［28］的研究结果一致，说明滇润楠幼苗通过提高脯氨酸含量来提高细胞的渗透势，维持细胞正常代谢，提高抗逆性。而游离脯氨酸和可溶性蛋白作为渗透调节物质，在Cd2+胁迫下表现出不同的趋势，可能是渗透胁迫物质所起的作用和调节机制不同，其原因有待于进一步研究。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是重要的抗氧化酶之一，在植物抵抗逆境胁迫过程中起着重要的作用［29］。本试验中，随着Cd2+处理浓度的增加，SOD活性变化不显著，而POD活性显著增加，这一结果与李卜等［30］在对枣树幼苗进行镉胁迫处理的研究中所得到的结果相似。SOD和POD活性的不同变化也说明了在逆境胁迫下不同抗氧化酶所起作用及机制并不相同，而本研究中滇润楠植株主要通过提高POD的活性来清除Cd2+胁迫下产生的自由基及缓解其膜脂过氧化作用。

综上所述，在Cd2+胁迫下，滇润楠幼苗叶片的荧光参数Fv/Fm、Yield呈下降趋势，叶绿素a和b含量降低，MDA含量显著增加，且这些指标的变化随着Cd2+胁迫浓度的增加而增加;此外，Cd2+胁迫处理下，抗氧化酶POD的活性及渗透调节物质脯氨酸含量也显著增加，说明该植株对于Cd2+具有一定的抗性;综合各项指标可以看出，滇润楠幼苗可以通过自身抗逆机制抵御10 mmol/L低浓度的Cd2+处理，而20 mmol/L高浓度的Cd2+处理将对该植株的生理生化性状及生长发育造成较大的伤害。

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