烟曲霉与人肺上皮细胞中E－cadherin相结合蛋白的初步研究

徐小勇，王 玉，孙 禾，张鹏鹏，施 毅

烟曲霉（Aspergillusfumigatus）是自然界中广泛存在的腐生微生物，也是一种非常重要的条件致病真菌。烟曲霉感染特别是侵袭性肺曲霉病预后差，即使正确的抗真菌治疗后，病死率仍高达50%［1］。目前，对于烟曲霉具体致病机制仍知之甚少［2－3］。肺泡上皮细胞是侵袭性肺曲霉病致病的第一站，曲霉孢子是借助何种侵袭因子与上皮细胞接触进而侵入宿主细胞目前仍未明确［4］。

病原体侵入宿主细胞的机制在产单核细胞李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、白念珠菌等侵入上皮细胞过程中有充分的研究［5－9］。李斯特菌侵袭因子internalin A（Inl A）的胞外段以15个β－sheet形成半圆型结构可以和上皮细胞黏附子E－cadherin的胞外结构EC1结合，从而介导了李斯特菌黏附侵入上皮细胞。先前的研究表明，cadherin参与了烟曲霉黏附侵袭宿主细胞的过程，即烟曲霉中存在可以和人E－cadherin结合的蛋白序列［10－11］。本研究拟通过生物信息学和分子生物学方法对烟曲霉中与cadherin结合的侵袭因子进行初步探讨。

材料与方法

一、烟曲霉中InlA相似序列的搜索

在PubMed上搜索李斯特菌的InlA氨基酸序列，记录其中参与结合E－cadherin的功能域富亮氨酸重复序列（leucine－rich repeats，LRRs），以此序列在烟曲霉基因组（Af293）查询相似序列（BLASTp）［12］。ExPASy Proteomics Server的Compute pI／Mw tool计算相关序列的相对分子质量和等电点，分析一级结构。

二、相似序列二级结构的预测

应用EXPASY（www.expasy.org／tools）上的PredictProtein（PHD，多重比对人工神经网络比对预测结构法）分析预测相似序列的二级结构。

三、三级结构预测

对同源性大于30%的蛋白上传至SWISSMODEL服务器开展模型构建工作，其他同源性不足的蛋白选择Phyre（Successor of 3D－PSSM），用swiss－pdb viewer分析观察模拟的三级结构。

四、免疫共沉淀

烟曲霉标准株（AF293）由我院微生物室提供，生长于沙保弱培养基后5 d，灭菌磷酸缓冲液（PBS）冲洗获取培养基表面的孢子，用16层纱布过滤，血球计数板计数后，用无血清DMEM培养液（Gibco）稀释到107个／mL，4℃储存备用。纯化的人E－cadherin蛋白购自北京义楚神州生物技术公司（100μg）。离心沉淀烟曲霉孢子，充分裂解，加入纯化E－cadherin 50μg，常规方法行免疫共沉淀，电泳分析其相对分子质量。

结果

一、Inl A中LRR的氨基酸序列

LRR的氨基酸序列为：IDGLEYLNNLTQINFSNNQLTDITPLKULTKLVDILMNNNQIADITPLANSSNLTGLTLFNNQITDIDPLKNLTNLNRLELSSNTISDISALSGLTSLQQLSFGNQVTDLKPLANLTTLERLDISSNKVSDISVLAKLTNLESLIATNNQISDITPLGILTNLDELSLNGNQLKUIG。

以此序列在烟曲霉AF293中搜索相似序列，见表1。结合对相似序列的描述，选择XP750927.1、XP750245.1、XP752100.1、XP748256.1进行进一步的分析。

相似序列一级结构的分析，见表2。

表1 曲霉基因组中的Inl A同源序列Table 1 Homologous sequences with InlA in Aspergillus fumigatus genome

表2 相似蛋白的基本信息Table 2 Basic information of relevant proteins

二、相似序列二级结构的预测

（一）XP750245.1的二级结构 蛋白的H螺旋结构占30.14%，β折叠占4.84%，无规则卷曲占65.02%。无穿膜序列及核定位序列。

（二）XP750927.1的二级结构 蛋白的H螺旋结构占9.63%，β折叠占7.98%，无规则卷曲占82.39%。无穿膜序列及核定位序列。

（三）XP752100.1的二级结构 蛋白的H螺旋结构占25%，β折叠占6.53%，无规则卷曲占68.47%。无穿膜序列及核定位序列。

（四）XP748256.1的二级结构 蛋白的H螺旋结构占40.98%，β折叠占17.32%，无规则卷曲占41.71%。预测7个穿膜序列，最高评分为0.893 1，为第239－257氨基酸残基。最高Zscore＝1.287。无核定位序列。

（五）三级结构的预测 通过将上述4蛋白的序列提交给SWISS－MODEL（同源重建）和Phyre服务器。XP750927.1和XP750245.1同源性较好采用swiss－model的同源重建，其余提交Phyre服务器，获得三维结构，见图1。提示XP752100.1、XP748256.1与InlA三维结构类似。

图1 烟曲霉中与InlA相似蛋白的三级结构模拟图Figure 1 The diagram of the tertiary structure of the proteins in Aspergillus fumigatus which are similar to Inl A

三、免疫共沉淀

烟曲霉蛋白组与人重组E－cadherin行免疫共沉淀，分离蛋白后行电泳分析。提示与E－cadherin结合的蛋白出现在43×103～55×103，见图2，箭头所示。

图2 烟曲霉中与E－cadherin可结合蛋白电泳图Figure 2 The protein binding to E－cadherin in Aspergillus fumigatus

在43×103～55×103区间存在一淡色条带，箭头所示，对照组缺失，提示在烟曲霉中存在此区间蛋白可以和人重组E－cadherin结合。

讨 论

烟曲霉孢子直径2～3μm，悬浮于空气中而易被宿主吸入到肺泡中，在宿主免疫力低下时，孢子躲避了肺泡巨噬细胞的吞噬而进入肺泡上皮细胞内，进而可发育成菌丝，侵袭性生长乃至全身播散。孢子进入肺泡上皮细胞是侵袭性肺曲霉病致病的第一步，研究其侵袭机制，特别是分子机制，针对特定靶位涉及药物可降低侵袭性肺曲霉病的病死率。

大规模高通量测序技术的进步带来了生物信息学快速发展，使生物信息学深入到各项生命科学研究中。在生物信息学的推动下，可以迅速了解蛋白质甚至是病原体和宿主相互作用的结构基础，推测出新的蛋白质相互作用［13－14］。蛋白质相互作用一般是通过特定的、较为保守的结构域完成，我们通过十分明确的李斯特菌InlA与上皮细胞E－cadherin相互作用机制推测烟曲霉中可能与cadherin结合的蛋白配体，并通过简单易行的蛋白质相互作用实验来初步探讨cadherin的配体。免疫共沉淀的方法初步表明，烟曲霉中与上皮细胞E－cadherin的蛋白相对分子质量为50×103，与生物信息学推测的XP748256.1相对分子质量类似，并有穿膜序列，表明了XP748256.1有可能为人肺泡上皮细胞E－cadherin的配体。从质量上分析，我们预测的蛋白与实际的蛋白质量上有一定的误差，这可能由于蛋白合成后存在糖化或其他的一些修饰反应而导致质量的变化。另外，电泳中的不规则迁移也可导致测定的质量发生误差，但误差一般不超过30%［15］，而我们目标蛋白恰在误差范围内。当然，最终蛋白的测定还需要质谱等检测来分析，并通过进一步的分子生物学的实验证实其作用。

绝大多数蛋白质现在还不能通过X线晶体衍射或磁共振来测定结构，因此需要通过生物信息学的预测方法来推断蛋白质的三维结构［16－17］。同源建模是最常用的建模方法［18］，但只有当目标研究蛋白的同源性在30%以上时结果才相对可靠。对同源性在30%以下的蛋白，THREADING预测法是近年发展起来的一种新方法［19］，我们选择基于此的Phyre对未知蛋白进行预测［20］。其主要原理是把未知蛋白质的氨基酸序列和蛋白质结构数据库中已明确的蛋白质折叠进行比对，选择最好的模型进行构建。

总之，通过初步的生物信息学和分子生物学推测，cadherin在烟曲霉蛋白XP748256.1可能为E－cadherin相关的结合蛋白，但需进一步的分子生物学技术来论证。

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