几种新现人体隐孢子虫种和基因型流行现状

杨子吟，曹建平，沈玉娟，刘爱芹

几种新现人体隐孢子虫种和基因型流行现状

杨子吟1，曹建平2，沈玉娟2，刘爱芹1

隐孢子虫是一种寄生于宿主胃肠道上皮细胞内的原虫。人感染后，免疫功能正常者，常引起自限性腹泻；但在高危人群(如儿童、老人和免疫缺陷者等)中可发生严重腹泻和肠外感染，尤其是艾滋病患者。目前，隐孢子虫的分子流行病学研究已鉴定了30个有效种和40多种基因型，其中21个隐孢子虫种和基因型在人体发现。人体隐孢子虫病多数由人隐孢子虫(C.hominis)和微小隐孢子虫(C.parvum)引起。火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)、泛在隐孢子虫(C.ubiquitum)、猫隐孢子虫(C.felis)和犬隐孢子虫(C.canis)引起的隐孢子虫病例也逐渐增多。除此之外，随着人体隐孢子虫病分子流行病学数据的增加，在人体内鉴定到一些新的隐孢子虫和基因型。特对上述新现的人体隐孢子虫种和基因型的流行现状进行综述。

隐孢子虫；隐孢子虫病；分子流行病学

隐孢子虫(Cryptosporidium)是寄生于脊椎动物胃肠上皮细胞内的一种寄生虫，由其感染引起的隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是一种新发的人兽共患原虫病。在免疫功能正常的个体，常引起自限性腹泻；在免疫功能缺陷者，尤其是艾滋病患者，可出现致死性腹泻[1]。早在1986年世界卫生组织将隐孢子虫病列为艾滋病怀疑指标之一。目前隐孢子虫已成为人类腹泻的第二大病因。

隐孢子虫卵囊在自然界中广泛存在，人通过摄入含有卵囊的食物、水以及接触污染物等途径感染该寄生虫[1]。人体隐孢子虫病是在1976年由Nime等首次报道[2]，此后隐孢子虫人体病例报道不断出现，并逐渐得到人们的重视。其中最值得关注的是1993年发生在美国密尔沃基市水源性隐孢子虫病暴发事件，该事件导致40多万人感染，100多人死亡；同时，这一事件证实隐孢子虫可耐受水处理，并通过饮用水传播[3]。隐孢子虫病呈世界性分布，已在90多个国家，至少300个地区发现了隐孢子虫病；在欧洲和北美洲人群平均感染率为1%～3%，亚洲为5%，非洲高达10%；在发达国家，免疫功能正常人群粪便隐孢子虫卵囊检出率为1%；在发展中国家，人的粪便隐孢子虫卵囊检出率达5%～10%[4]。国内韩范于1987年在南京首先发现了人体隐孢子虫病病例以来，目前有19个省出现人体隐孢子虫感染的报道[5]。 隐孢子虫是顶复门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美耳亚目、隐孢子虫科、隐孢子虫属的原生动物。自从1907年Tyzzer首次在实验小鼠的胃腺黏膜上皮细胞内分离到隐孢子虫以来[6]，随着基因分型技术在人体隐孢子虫病流行病学调查中应用，到目前为止，已经在人和260多种动物体内鉴定出30个隐孢子虫种和40多个基因型，其中在人体发现了21个种和基因型[1,7]。绝大多数人体隐孢子虫病由微小隐孢子虫(C.parvum)和人隐孢子虫(C.hominis)引起[1]。近些年来，随着人体分子流行病学调查的深入开展，由火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)、泛在隐孢子虫(C.ubiquitum)、猫隐孢子虫(C.felis)、犬隐孢子虫(C.canis)引起的隐孢子虫病例也逐渐增多，且在某些国家和地区，个别虫种呈现地区优势性[1]。除此之外，近年来，在人体还分离到了安氏隐孢子虫(C.andersoni)、兔隐孢子虫(C.cuniculus)、鼠隐孢子虫(C.muris)、牛隐孢子虫(C.bovis)、旅行者隐孢子虫(C.viatorum)、泰泽隐孢子虫(C.tyzzeri)、猪隐孢子虫(C.suis)、肖氏隐孢子虫(C.xiaoi)、种母猪隐孢子虫(C.scrofarum)、费氏隐孢子虫(C.fayeri)、刺猬隐孢子虫(C.erinacei)、隐孢子虫马基因型(Cryptosporidiumhorse genotype)、隐孢子虫臭鼬基因型(Cryptosporidiumskunk genotype)、隐孢子虫花栗鼠基因型Ⅰ(Cryptosporidiumchipmunk genotype I)和隐孢子虫貂基因型(Cryptosporidiummink genotype)。目前，人们对这些新现的隐孢子虫种和基因型的研究及认识相对缺乏，本文将对上述人体隐孢子虫种和基因型的分子流行病学现状进行综述。

1 安氏隐孢子虫

安氏隐孢子虫是在2000年从鼠隐孢子虫独立出来的隐孢子虫种[8]。牛是安氏隐孢子虫的主要保虫宿主，常见于成年牛和青年牛。此外，在仓鼠、骆驼、绵羊、山羊、马、貂体内也分离到该虫种[9-11]。安氏隐孢子虫人体病例首次在英国发现[12]。此后马拉维、澳大利亚和伊朗均出现1例安氏隐孢子虫病例，其中伊朗的隐孢子虫病患者同时感染了HIV病毒[13-15]。我国于2014年首次在上海的34个腹泻患者粪便中检出安氏隐孢子虫[16]。同年，Jiang等在江苏省的腹泻患者体内检测到21名安氏隐孢子虫感染者，其中以婴幼儿与老年人居多[17]。虽然近年来国内外已经出现人体安氏隐孢子虫病例报告，但亚型水平的分子数据匮乏，其感染源和传播动力学还不清楚。因此，开展人体安氏隐孢子虫分离株多基因位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)的研究是当前的主要工作。

2 兔隐孢子虫

兔隐孢子虫是在2010年正式命名的隐孢子虫种，兔是兔隐孢子虫主要自然感染宿主，因此在此之前一直被称作隐孢子虫兔基因型(Cryptosporidiumrabbit genotype)[18]。2014年在澳大利亚的袋鼠体内发现该种[19]。兔隐孢子虫引起学者的重视源于2008年英国的水源性隐孢子虫病暴发事件。当时在23名腹泻患者的粪便样本中鉴定到了兔隐孢子虫；而对7份污染水样、一只死兔以及9名患者兔隐孢子虫分离株的亚型分型结果证实，所有兔隐孢子虫分离株亚型均为VaA18，确认了水箱内的死兔是此次暴发事件的污染源[20]。此后，英国、法国、尼日利亚、澳大利亚和西班牙均出现了人体感染兔隐孢子虫的报道[19,21-24]。兔隐孢子虫有2个亚型家族，Va家族常见于人体，而Vb家族常见于兔体[7]。目前，人体发现的在20个隐孢子虫亚型中Va家族中8个亚型，Vb家族中12个亚型[7]。其中有6个人兽共患的亚型(VaA18、VaA19、VbA28、VbA29、VbA32和VbA36)[7]，兔隐孢子虫人兽共患的可能性在亚型水平得到证实。因此，加强兔的粪便管理及兔的密切接触者的安全卫生教育是十分必要的。

3 鼠隐孢子虫

鼠隐孢子虫是在1907年被发现和命名的隐孢子虫有效种，主要自然宿主是啮齿类动物[6]。近年，在鸵鸟、马、猪以及蛇等爬行类动物体内也发现了该虫种[1,25]。目前，鼠隐孢子虫人体病例报道主要集中于免疫功能缺陷者，尤其是HIV病人：2001年至2012年间，在法国、泰国、肯尼亚、秘鲁、印度和巴西均出现过HIV及免疫缺陷患者感染鼠隐孢子虫的报道[26-31]。另外，斯洛伐克以及沙特阿拉伯儿童体内发现鼠隐孢子虫[32-33]。同时，在印度尼西亚、伊朗和斯洛伐克免疫功能正常成人的体内检测到鼠隐孢子虫[34-36]。然而，鼠隐孢子虫传染源和传播动力学的资料还很匮乏。Feng等在2011年通过对2个人源鼠隐孢子虫分离株在MS1、MS2、MS3和MS16位点亚型分型，获得了2个MLST亚型(M1, M2, M4, M5和M6, M4, M1, M2)；而鼠体内的鼠隐孢子虫分离株MLST亚型M1, M2, M4, M5的发现，在基因亚型水平证明了鼠隐孢子虫动物性传播的可能性[37]。

4 猪隐孢子虫

猪隐孢子虫是在2004年命名的一个隐孢子虫种，以前称其为隐孢子虫猪基因型1(Cryptosporidiumpig genotype I)[38]。猪是猪隐孢子虫主要保虫宿主[1]。近些年来，在牛、啮齿类动物、黑猩猩和羊体内也分离到了猪隐孢子虫[1,39-40]。2002年首次在秘鲁一名24岁HIV感染者的体内鉴定到猪隐孢子虫[41]。在2007年和2013年分别在秘鲁和我国发现1例HIV病毒合并猪隐孢子虫感染病例[42-43]。此外，在英国和马达加斯加有消化系统症状的患者体内发现猪隐孢子虫感染[12,39]。目前，由于没有治疗隐孢子虫病有效的药物或预防疫苗，因此，开展猪隐孢子虫流行病学调查，加强猪粪便的处理，避免其污染环境是预防人体猪隐孢子虫感染主要措施之一。

5 旅行者隐孢子虫

该隐孢子虫是2012年首次在由印度返回英国的游客中发现的，因此将其命名为旅行者隐孢子虫[44]。其后，2013年在瑞典的2名腹痛、腹泻以及恶心等消化系统症状患者的粪便中检测到该虫体；2人在患病前均有国外旅游史，旅游地分别是危地马拉和肯尼亚[45]。在2013年和2014年，分别在1名尼日利亚和10名埃塞俄比亚HIV/AIDS体内分离到该病原体[46-47]。亚型分型发现其种内有6个亚型(XVaA3f、XVaA3e、XVaA3d、XVaA3c、XVaA3b和XVaA3a)[48]。目前，旅行者隐孢子虫种只在人体发现，该虫种的传染源和传播途径还不清楚，这是将来流行病学研究工作的重点。

6 牛隐孢子虫

牛隐孢子虫是2005年命名的隐孢子虫种，在此之前，被称作隐孢子虫牛基因型B(Cryptosporidiumgenotype bovine B)[49]。牛是牛隐孢子虫的主要感染宿主，猩猩和狍子体内也发现过该病原体[1,50]。2001年在法国的1名免疫功能正常者、2名HIV患者和2名淋巴瘤患者的体内鉴定到牛隐孢子虫，这是牛隐孢子虫在人体的首次发现[27]。2012年在澳大利亚，生活在奶牛农场内的1个儿童和1个成年人体内发现了牛隐孢子虫[51]。2013年，埃及的10名腹泻儿童感染牛隐孢子虫[52]。虽然人体牛隐孢子虫病例不多，但是其所引起的健康问题不能忽视，尤其是与牛密切接触的儿童以及免疫力缺陷的人群。

7 泰泽隐孢子虫

泰泽隐孢子虫是在2012年正式命名的一个隐孢子虫种，此前被称为隐孢子虫鼠基因型1(Cryptosporidiummouse genotype I)[53]。泰泽隐孢子虫主要宿主是啮齿类动物，马和蛇体内也检测到了该虫种[25]。2005年泰泽隐孢子虫首次在一名科威特儿童腹泻便中检出(当时被错误的报道为C.parvumIIf 亚型家族)[54]。2013年，在捷克的一名腹泻成年女性体内检测到泰泽隐孢子虫，该患者还合并感染微小隐孢子虫；经调查，这名患者曾用啮齿类动物进行过实验研究，通过gp60亚型分型，证实传染源就是实验用的野鼠[55]。鼠是自然界常见的啮齿类动物，数量大，分布广，繁殖快，适应性强，危害严重。目前，已证实鼠携带200多种病原体，其中57种是人兽共患的，包括隐孢子虫[56]。因此，降低鼠密度、减少人与鼠的直接或间接接触是预防泰泽隐孢子虫感染的关键。

8 肖氏隐孢子虫

肖氏隐孢子虫以前被认为是类牛隐孢子虫(C.bovis-like)，主要见于羊体内，在2009年以美国华裔科学家肖立华的名字命名为一个隐孢子虫种[57]。研究发现，绵羊和山羊是肖氏隐孢子虫的主要宿主[1]，另外，鱼和袋鼠也可感染该虫[1,58]。2014年，在对埃塞俄比亚520名HIV/AIDS患者隐孢子虫分子流行病学调查时，发现了2例肖氏隐孢子虫感染者，临床症状主要表现为呕吐[46]。由于人体肖氏隐孢子虫病例较少，其与临床表现的相关性还不清楚；传染源和传播途径也有待研究。

9 种母猪隐孢子虫

种母猪隐孢子虫于2013年由Kvác等命名，以前被称为隐孢子虫猪基因型2(Cryptosporidiumpig genotype II)[59]。猪是种母猪隐孢子虫主要宿主，但在羊、鼠甚至鱼的体内也发现该虫种[1,60]。目前，只有1例种母猪隐孢子虫合并贾第虫集聚体A人体感染，该病例报道于2009年[61]。根据病史，作者认为与接触患病动物、食用被污染食物或者饮用被污染的水是该病的直接或间接原因[61]。该病例提示应改善猪的饲养管理，尤其是种母猪，避免仔猪的感染；同时，加强对猪粪便的处理，避免环境污染和人体感染。

10 费氏隐孢子虫

费氏隐孢子虫曾被称为隐孢子虫袋鼠基因型1(Cryptosporidiummarsupial genotype I)，2008年Ryan等将其命名为费氏隐孢子虫[62]。有袋类动物是其主要宿主，在绵羊体内也曾检测到该寄生虫[1]。2010年Waldron等报道了1例费氏隐孢子虫人体感染，患者是一位澳大利亚29岁免疫功能正常女性，长期腹泻；通过gp60基因分析，确定其亚型为IVaA9G4T1R1[63]。相同的亚型也在袋鼠体内鉴定[64]，有袋类动物可能为人类费氏隐孢子虫动病的传染源。目前，费氏隐孢子虫内发现6个亚型家族(IVa-IVf)，其人兽共患性还有待探究。

11 刺猬隐孢子虫

刺猬隐孢子虫是在2014年由Kvac等命名的新种，它在2002年被首次发现，当时称其为隐孢子虫刺猬基因型(Cryptosporidiumhedgehog genotype)[65]。顾名思义，刺猬是主要宿主，在马体内也发现该虫种[66]。到目前为止，刺猬隐孢子虫仅有1例人体病例报道，该患者为26岁青年男性，免疫功能正常，因肠胃炎伴腹痛入院就诊；gp60基因序列分析，该分离株的亚型为XIIIaA20R10[67]。刺猬隐孢子虫是新现的隐孢子虫种，目前，仅发现1个亚型家族(XIIIa)内的2种基因亚型(XIIIa20R10和XIIIaA22R9)[1,66]。由于该虫种分子数据较少，其传染源和传播途径有待进一步研究。

12 隐孢子虫马基因型

该基因型首次在一匹普氏野马(Equusferusssp.Przewalskii)体内发现[68]。马是其主要的宿主，在驴、犊牛和刺猬的体内也有报道[11]。自从2008年Robinson等首次报道了人体感染隐孢子虫马基因型以来[69]，2009年和2012年相继在美国和英国分别发现1例和2例马基因型感染者[70-71]。其中前者通过对gp60基因序列分析，获得了VIbA13亚型[70]，相同的基因亚型也在一个日本的刺猬体内发现[11]。目前，隐孢子虫马基因型内存在2个亚型家族。VIa主要发现于马(VIaA15G4、VIaA11G3、VIaA14G2)，还见于驴(VIaA15G4、VIaA11G3)以及犊牛(VIaA14G4)，但至今未在人体发现，VIa亚型家族，它是否能够感染人体有待将来的研究证实。而VIb主要见于人和刺猬[11]，该结果表明了隐孢子虫马基因型VIb家族动物源性传播的可能。

13 隐孢子虫花栗鼠基因型

隐孢子虫花栗鼠基因型主要宿主是花栗鼠，该基因型还在野生动物东方灰松鼠、鹿鼠和红松鼠体内发现[72]。2006年Feltus等首次在美国威斯康星州发现了2例隐孢子虫花栗鼠基因型1人体感染(当时命名为W17)[73]。后来，在法国的1名HIV病人、瑞典的1名2岁女童和1名56岁男性体内鉴定到该病原体[22,74]。2015年Guo等对25个人源和3个鼠源隐孢子虫花栗鼠基因型1分离株gp60基因序列分析，发现了14个亚型：人体内12个；鼠体内2个[72]。此外，在水体中鉴定到隐孢子虫花栗鼠基因型1新的亚型XIVaA15G2T1[72]。由于隐孢子虫花栗鼠基因型1人体分离株和野生鼠分离株遗传学上的相似性[72]，提示其存在人兽共患的可能。

14 隐孢子虫臭鼬基因型

隐孢子虫臭鼬基因型比较罕见，动物宿主仅包括缟臭鼬、浣熊和松鼠[75]。目前，仅有2个隐孢子虫臭鼬基因型人体感染病例，均来自于英国[69,71]。其中一名患者在发病前曾去过森林公园度假[69]。由于隐孢子虫臭鼬基因型无论在基因型还是亚型水平的分子数据均比较缺乏，目前，仅在水体中鉴定到1个臭鼬基因型的亚型XVIa[72]，因此，其人兽共患可能性以及与临床表现的相关性还依赖于更多的分子流行病学调查来证实。

15 隐孢子虫貂基因型

2008年首次在貂体内发现隐孢子虫貂基因型[76]。至今，貂仍然是该病原体的唯一动物宿主。隐孢子虫貂基因型仅有2个人体病例，均来自澳大利亚。其中，2013年报道的1例合并感染火鸡隐孢子虫和一个未确定隐孢子虫种[79]。目前，该基因型内分为4个亚型家族，均来自于貂[77]，由于缺乏人源隐孢子虫貂基因型的亚型数据，其人兽共患性还有待查证。

上述15个新现人体隐孢子虫种和基因型的宿主范围和病例的国家分布情况总结于表1。

表1 人体新现隐孢子虫种和基因型的宿主范围和地理分布
Tab．1 The host range and geographical distribution of several emergingCryptosporidiumspecies and geno types in humans

种/基因型(Species/Genotypes)宿主(Host)主要宿主(Majorbost)少见宿主(Minorhost)国家(病例数)Country(No.ofcases)安氏隐孢子虫(C.andersoni)牛人、仓鼠、骆驼、绵羊、山羊、貂中国(55);伊朗(1);澳大利亚(1);马拉维(1);英国(3)兔隐孢子虫(C.cuniculus)兔人、袋鼠西班牙(1);澳大利亚(1);英国(60);尼日利亚(5);法国(1)鼠隐孢子虫(C.suis)啮齿类动物人、鸵鸟、马、猪、蛇斯洛伐克(7);美国(1);沙特阿拉伯(1);伊朗(4);印度(1);秘鲁(1);肯尼亚(1);泰国(1);法国(1);印度尼西亚(2)猪隐孢子虫(C.suis)猪人、牛、啮齿类动物、黑猩猩、羊马达加斯加(1);中国(1);秘鲁(2);英国(1)旅行者隐孢子虫(C.viatorum)人尼日利亚(1);英国(10);瑞典(2);埃塞俄比亚(10)牛隐孢子虫(C.bovis)牛人、猩猩、狍子澳大利亚(2);埃及(10);法国(5)泰泽隐孢子虫(C.tyzzeri)啮齿类动物人、马、蛇捷克(1);科威特(1)肖氏隐孢子虫(C.xiaoi)羊人、鱼、袋鼠埃塞俄比亚(2)种母猪隐孢子虫(C.scrofarum)种母猪人、羊、鼠、鱼捷克(1)费氏隐孢子虫(C.faveri)有袋类动物人、绵羊澳大利亚(1)刺猬隐孢子虫(C.erinacei)刺猬人、马捷克(1)隐孢子虫马基因型(C.horsegen-otype)马人、驴、犊牛、刺猬英国(3);美国(1)隐孢子虫花栗鼠基因型1(C.chip-munkgenotypeⅠ)花栗鼠人、东方灰松鼠、鹿鼠、红松鼠瑞典(2);法国(1);美国(2)隐孢子虫臭鼬基因(C.skunkgen-otype)缟臭鼬人、浣熊、松鼠英国(2)隐孢子虫貂基因型(C.minkgeno-type)貂人澳大利亚(2)

从1907年首次发现隐孢子虫至今，对隐孢子虫分类及分子流行病学研究已经取得了重大的进展。隐孢子虫gp60基因亚型分型技术已经广泛用于人体隐孢子虫病传染源的追踪和传播动力学的研究等。目前，基于gp60基因序列分析，已有16个隐孢子虫种和基因型成功地进行了亚型分型；其中有13个能够感染人体，包括人隐孢子虫、微小隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、费氏隐孢子虫、兔隐孢子虫、隐孢子虫马基因型、泰泽隐孢子虫、隐孢子虫貂基因型、泛在隐孢子虫、刺猬隐孢子虫、隐孢子虫花栗鼠基因型、旅游者隐孢子虫、隐孢子虫臭鼬基因型[1,48,72]。用于鼠隐孢子虫和安氏隐孢子虫的MLST多位点序列亚型分型技术也已经建立[37]。然而，还有一些对人体具有感染性的隐孢子虫种，如猫隐孢子虫、犬隐孢子虫、牛隐孢子虫、猪隐孢子虫、肖氏隐孢子虫、种母猪隐孢子虫，目前尚缺乏有效的亚型分型工具。构建通用的隐孢子虫亚型分型工具应成为今后隐孢子虫科学研究的重点。

人体隐孢子虫病流行病学资料表明，隐孢子虫不仅能够感染免疫功能缺陷和免疫功能低下的人群，还可以感染免疫功能正常的成人。这些分子流行病学数据为我国隐孢子虫病的预防有着重要的指导意义。为了控制这种疾病的广泛传播，需要加强公众对隐孢子虫病传染源以及传播途径的了解。由于目前没有有效的治疗药物和疫苗，因此，加强人和动物粪便的处理、避免环境污染、培养良好的卫生习惯是预防隐孢子虫病的主要措施。

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YANG Zi-yin1,CAO Jian-ping2, SHEN Yu-juan2, LIU Ai-qin1

(1.DepartmentofParasitology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China;2.NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,WHOCollaboratingCentreforMalaria,MinistryofHealth;NationalCenterforInternationalResearchonTropicalDiseases,MinistryofScienceandTechnology,SchistosomiasisandFilariasisKeyLaboratoryofParasiteandVectorBiology,Shanghai200025,China)

Cryptosporidiumspp. are protozoan parasites that infect the epithelial cells of the gstrointestinal tract of hosts. In humans, cryptosporidiosis is usually a self-limiting infection in immunocompetent individuals, but severe diarrhea and dissemination to extra-intestinal sites can occur in high-risk individuals, such as the very young, the elderly，immunedeficiency individuals,particularly in HIV-positive patients. So far, molecular epidemiological data have confirmed the presence of 30 species and over 40 genotypes with genusCryptosporidium, with 21 species and genotypes being found in humans. The majority of human cryptosporidiosis cases are responsible forC.hominisandC.parvum. Human cases caused byC.meleagridis,C.ubiquitum,C.felisandC.canishave been increasing. Besides that, with data accumulation of molecular epidemiology of human cryptosporidiosis, some moreCryptosporidiumspecies and genotypes were newly identified in humans. This paper mainly reviews epidemiology status of these new emergingCryptosporidiumspecies and genotypes in humans.

Cryptosporidium; cryptosporidiosis; molecular epidemiology; humans

Liu Ai-qin, Email: liuaiqin1128@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.011

国家卫生和计划生育委员会2015公益性行业科研专项(No. 201502021)和黑龙江省教育厅课题(No.12531266)联合资助

刘爱芹，Email：liuaiqin1128@126.com

1.哈尔滨医科大学寄生虫学教研室，哈尔滨 150081； 2.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，世界卫生组织热带病合作中心，科技部国家级热带病国际联合研究中心，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，上海 200025

R382

A

1002-2694(2017)02-0148-08

2016-07-21 编辑： 李友松

Supported partially by the Chinese Special Program for Scientific Research of Public Health (No. 201502021) and the Heilongjiang Province Education Bureau (No.12531266)