叶酸受体在食管癌细胞中的表达及其与食管癌生物学行为的关系

李秋元 林晓斌 陈杰武 郭光华

AKT又称蛋白激酶(PKB), 其活性形式为磷酸化蛋白激酶B(P-Akt), 位于多种基因信号通路的核心部位, PI3K/AKT信号通路广泛存在于细胞中, 是参与细胞生长﹑增殖﹑凋亡﹑分化调节的重要信号通路, 研究发现, FR在人食管癌细胞中异常高表达［1］, 而hnRNP-E1作为FR的转录调节因子, 在小鼠的乳腺上皮癌中, hnRNP-E1与PI3K/AKT信号通路存在一定的关系, 但在人食管癌细胞中是否存在关联目前尚未报道。本实验通过PI3K/AKT信号通路靶向抑制剂LY294002对人食管癌EC109细胞作用, 以探讨PI3K/AKT信号通路与FR表达之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管癌细胞系EC109由汕头大学医学院第一附属医院分子生物学实验室培养, LY294002﹑胰蛋白酶(江苏碧云天)﹑胎牛血清(杭州四季青), RPMI1640(无叶酸)(GIBCO公司), 二甲基亚砜﹑四甲基偶氮唑蓝(MTT)﹑AKT,P-Akt抗体 (CST)﹑hnRNP-E1(Santa Cruz), FR 抗体 (ENZO)。

1.2 方法

1.2.1 LY294002工作液的配置及细胞培养 将20 μL(10 mg/ml)LY294002 溶液加入到 630 μLPBS 中 , 稀释成 1000 μmol/L 的溶液, 置于-20℃冰箱中储存, 使用前再稀释成指定浓度, 将食管癌细胞EC109加入含10%胎牛血清的无叶酸RPMI1640培养基中, 置于37℃, 5%CO2饱和湿度条件下培养, 每2～3 d传代一次。

1.2.2 MTT 法检测细胞生长活性 实验分组：空白对照组和实验组, 实验组分为终浓度10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/l LY294002组。取对数生长期的食管癌细胞EC109, 用0.25%胰酶消化, 离心收集后用无叶酸RPMI1640培养基配制成5×104个细胞/ml的悬液, 接种于96孔板, 每孔细胞数约为6000,置于37℃, 5%CO2饱和湿度条件下过夜。实验组分别给予终浓度为 10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/L LY294002, 总体积200 μL。每组5个复孔, 分别培养8 h﹑12 h﹑24 h后,每孔分别加入5 mg/ml的MTT10 μl继续培养4 h后去上清液, 再加入DMSO150 μL,水平震荡20 min。用酶标仪在波长490 m处测细胞增殖的抑制率：细胞抑制率=(1-实验组平均OD490值/对照组平均OD490值)×100%

1.2.4 流式细胞术检测食管癌细胞中FR的表达 收集经10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/L LY294002 作用 24h 后的实验组﹑空白对照组和同型对照组细胞, 用PBS洗涤3次,弃上清,各实验组分别加入1 ml FR-FITC, 空白对照组加入1mlPBS,同型对照组加入1ml IgG-FITC(0.25 μg/ml), 37℃避光孵育1 h后, 用PBS洗涤2次, 弃上清, 各组加入500 μlPBS悬浮细胞,上机检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY294002对食管癌细胞EC109的生长抑制效应 MTT法检测结果显示, 随着时间延长, 浓度加大, 细胞增殖抑制率呈现时间-效应关系, 浓度-效应关系, 各浓度组分别与其对照组相比差异有统计学意义(*P＜0.05, 表1)

表1 LY294002对EC109细胞的增殖抑制率(±s, %)

表1 LY294002对EC109细胞的增殖抑制率(±s, %)

*P＜0.05(药物作用组VS对照组)

LY294002浓度（μmol/l）8h 12h 24h OD值 抑制率（%） OD值 抑制率（%） OD值 抑制率（%）空白对照组 0.59±0.01 0 0.64±0.04 0 0.96±0.04 0 10 0.55±0.02* 8.11 0.59±0.02* 8.02 0.86±0.02* 10.41 20 0.54±0.01* 9.72 0.55±0.03* 13.81 0.80±0.08* 16.55 30 0.45±0.01* 23.89 0.48±0.01* 25.95 0.73±0.03* 28.72 40 0.43±0.01* 28.49 0.45±0.01* 29.63 0.67±0.06* 30.47 50 0.38±0.01* 36.45 0.40±0.01* 38.36 0.58±0.07* 39.16

3 讨论

PI3K/AKT处于众信号通路的中心地位, 其重要性日益受到关注, 研究表明多种肿瘤组织中存在AKT基因的过度表达和活化［2］, 而在食管癌组织细胞中也呈现出高表达状态［3］。本实验通过使用PI3K/AKT 信号通路特异性抑制剂LY294002作用于人食管癌EC109细胞, 采用MTT法检测细胞的增殖抑制率, 实验结果显示, 随着药物作用浓度的增大和作用时间的延长, 增殖抑制率逐渐降低, 存在统计学意义(P＜0.05)。其机制可能是LY294002通过抑制AKT的磷酸化水平, 使得细胞周期蛋白降解增加﹑表达减少, 促使细胞停滞于G0/G1期, 细胞增殖明显受到抑制, 死亡细胞增多。

叶酸, 又名维生素B11, 是一种水溶性维生素, 在体内参与一碳单位的转移反应和嘌呤﹑胸腺嘧啶的合成, 叶酸缺乏与DNA损伤﹑修复和甲基化异常密切相关, 而后者是肿瘤发生的重要环节, hnRNP E1可调节mRNA的稳定性, 同时参与成熟mRNA的转运, 定位［4］。本实验用LY294002作用食管癌细胞24h后, 用流式细胞技术检测FR的表达水平。结果显示FR的表达较对照组明显降低, 提示叶酸受体的表达与PI3K/AKT通路存在一定的联系, 其中, 可能与抑制PI3K/AKT通路, 使得细胞增殖减少, 从而所需的叶酸受体减少有关, 另一方面也可能是通过抑制通路PI3K/AKT,影响了hnRNP-E1的磷酸化水平, 而hnRNP-E1做为FR转录的调控因子, 可进一步影响FR的转录, 最终使得FR的表达减少。

综上所述, 阻断PI3K/AKT信号转导通路可以明显抑制人食管癌EC109细胞的增殖, 同时影响FR的表达, 但FR是否可反作用通过PI3K/AKT信号转导通路作用食管癌细胞的生物学行为有待进一步研究。

［1］ 刘璇芝, 陈素钻, 俞晶, 荆绪斌, 李秋元, 郭光华.叶酸受体α在食管癌及癌旁组织表达和患者饮食习惯的关系.广东医学,2008,26(3):456-458.

［2］ Mariette C, Finzi L, Fabre S, et al Factors predictive of complete,resection of operable esophageal cancer: a prospective study.Ann Thorac Surg, 2003, 75(6): 1720-6.

［3］ 曹伟, 于在诚, 刘芝华, 骆爱萍.磷酸化AKT在食管鳞癌中的表达及其临床意义.安徽医科大学学报, 2008,45(1):24-4

［4］ Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al.Global Cancer Statistics, 2002.CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.