抗GPC3 C端抗体辅助杀伤肝癌细胞HepG2的活性检测及抗原表位鉴定

张红飞 ，张慧娜 ，李军锋 ，于虹 ，代晓朋 ，赵光宇 ，郭彦 ，王凯娟 ，张建营 ，周育森

1.郑州大学 公共卫生学院，河南 郑州 450001；2.军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈上升趋势[1]。我国肝癌的发病率及死亡率均位于恶性肿瘤的第二位[2]。早期诊断、早期治疗对提高肝癌患者的生存质量具有十分重要的意义。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）是硫酸类肝素蛋白聚糖家族成员，其相对分子质量为60×103～70×103，通过糖基磷脂酰肌醇结合于细胞表面[3]。研究表明，GPC3在肝癌细胞中异常表达，而在正常肝细胞和其他非肿瘤肝病细胞表面未见表达[4-7]，使得GPC3可能成为新的血清学指标，用于肝癌患者的早期诊断[8]。GPC3除了在肝癌诊断上的应用之外，其膜蛋白的性质决定了其可以作为免疫治疗靶点。Ishiguro等发现，制备的抗 GPC3 C端（524～563残基）单克隆抗体可以在体外抑制Huh7细胞的生长，其辅助杀伤肿瘤活性在于其参与的抗体依赖细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxity，ADCC）作用，裸鼠体内移植模型研究发现，抗GPC3抗体GC33可以抑制HepG2或Huh7移植模型的肿瘤生长，并促进化疗药物对肿瘤的杀伤作用，同时能明显降低表达GPC3的肝癌鼠血清GPC3和甲胎蛋白（AFP）水平[9-12]。

抗体是否诱导ADCC或补体依赖的细胞毒性（CDC）杀伤肿瘤活性，主要取决于其识别的表位[9]。为了寻找抗肝肿瘤更为有效的抗体，前期我们制备了7株抗GPC3 C端（编码359～580残基）的单克隆抗体[13]，在本研究中，我们检测了这7株单抗是否通过ADCC杀伤肝肿瘤细胞，并分析了其识别的表位。

1 材料与方法

1.1 材料

7株抗GPC3 C端单抗由本室制备；HepG2细胞由本研究室留存；大肠杆菌DH5α感受态和BL21（DE3）感受态、小量质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒、DNA标准marker均购自北京全式金生物技术有限公司；克隆载体pMD18-T、限制性内切酶、SolutionⅠ连接酶均购自TaKaRa公司；原核表达载体 pGEX-4T-1、苯甲基磺酰氟（PMSF）购自 Amer⁃sham公司；IPTG购自Promega公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司；ELISA用显色液和终止显色液购自北京万泰药业有限公司；多功能酶标仪购自BioTek公司；West⁃ern印迹显色试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基购自Gibico公司；重组人白细胞介素2（IL-2）购自北京双鹭药业公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 抗GPC3 C端抗体辅助杀伤肝肿瘤细胞的活性检测

单克隆抗体的杀伤肿瘤活性检测使用细胞增殖法[14]检测ADCC效应，以小鼠脾细胞为效应细胞，靶细胞为表达GPC3的肝癌细胞HepG2。实验分为ADCC杀伤组、效应细胞非特异杀伤组、抗体非特异毒性对照组和单独靶细胞组。其中，ADCC杀伤组体系中包含效应细胞、靶细胞和单抗（共7个处理，分别用1～7号单抗），效应细胞非特异杀伤组体系中包含效应细胞和靶细胞，抗体非特异毒性对照组包含靶细胞和单克隆抗体（共7个处理，分别用1～7号单抗），单独靶细胞组只包括HepG2靶细胞。靶细胞数目为8000/孔，效应细胞与靶细胞的比例为2∶1。另外，每组均加入重组人IL-2 100 U/mL。每组均重复6次。

上述体系加入96孔细胞培养板中，于5%CO2、37℃培养箱中培养72 h后，在样品和空白孔中每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，于5%CO2、37℃培养箱中继续培养4 h，吸弃孔内上清，每孔加入150 μL DMSO混匀溶解后测量D490nm值，以检测存活的细胞数目。以P＜0.05为检验水准，判定ADCC杀伤组与效应细胞非特异杀伤组间D490nm值、抗体非特异毒性对照组与单独靶细胞组间D490nm值差异是否具有统计学意义，从而判定不同抗体是否具有辅助杀伤肝肿瘤的活性。

1.3 GPC3 C端蛋白的截短表达载体构建

根据GenBank中GPC3已知序列（GenBank登录号：L47125.1），用生物信息学分析软件GoldKey对GPC3 C端进行蛋白结构及抗原表位分析，预测其优势表位，并据此将其分4个片段进行截短表达，分别命名为F1～F4，设计克隆引物名称和序列如表1。

以前期构建的含GPC3 C端359～580残基编码基因的质粒为模板，PCR扩增F1～F4编码基因，分别连接pMD18-T克隆载体，经序列测定后将序列正确的克隆用BamHⅠ和SalⅠ酶切，回收目的片段后分别连接经同样酶切回收的pGEX-4T-1原核表达载体，氨苄西林抗性选取单克隆菌落，扩增后提取质粒，用PCR方法鉴定，扩增片段理论大小分别为213、153、153和195 bp。将经PCR鉴定正确的质粒交北京奥科鼎盛生物科技公司测序，正确重组的克隆分别命名为pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3CF4。

表1 GPC3 C端截短片段基因克隆引物

1.4 GPC3截短片段重组蛋白的表达及纯化

将构建的pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3C-F4质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，以1 mmol/L IPTG诱导4 h以表达蛋白，离心收菌后加入PBS重悬，以4×SDS上样缓冲液处理样品，以未诱导细菌为对照进行SDS-PAGE，分析GST-GPC3CF1～GST-GPC3C-F4共4种蛋白的表达，4种蛋白的理论相对分子质量分别约为 34×103、32×103、32×103和33×103。将成功表达的克隆菌转接250 mL LB培养液，IPTG过夜诱导以大量表达蛋白，离心收菌后加入超声缓冲液（20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，pH7.8）和终浓度为1 mmol/L的PMSF，用超声波细胞破碎机以100 W的功率超声15 min，离心后沉淀以包涵体洗涤液（50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5% Triton-X100）洗涤3次后溶于含8 mol/L尿素的包涵体溶解液中，样品于-80°C保存。采用已报道的方法[15]切胶回收，浸提纯化蛋白后进行SDS-PAGE，观察4种蛋白的纯化结果。

1.5 间接ELISA法分析抗GPC3 C端单克隆抗体识别的表位

将纯化的 GST-GPC3C-F1～GST-GPC3C-F4蛋白定量后分别稀释至 0.5 μg/mL，100 μL/孔、4℃过夜包被于酶标板中，每种蛋白包被一个96孔板。以封闭液（含2%BSA的PBS溶液）封闭后，均以不加抗体作为阴性对照，以7株抗GPC3 C端单抗（以1∶100为起始稀释度，倍比稀释12个梯度）为一抗、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000稀释）为二抗。分别加入一抗和二抗，37℃各温育1 h后加入显色液显色10 min，终止显色，以多功能酶标仪测定D450nm值，观察各抗体在以不同片段蛋白包被情况下的D450nm值大小及随抗体浓度下降D450nm值的下降情况，以初步判定其表位结合情况。

1.6 Western印迹分析抗GPC3 C端单克隆抗体识别的表位

将GST-GPC3 C端全长蛋白及纯化的GSTGPC3C-F1～GST-GPC3C-F4蛋 白 进 行 7次 SDSPAGE，电转移至PVDF膜上，转移后的膜于封闭液（含5%脱脂牛奶的TBS溶液）中封闭后，分别与7株抗GPC3 C端单抗（1∶500稀释）和HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000稀释）共孵育，洗膜后加入化学发光剂ECL，在暗室中曝光，显影，定影，在胶片上获得相应的条带，观察各抗体与GST-GPC3 C端全长蛋白及纯化后的GST-GPC3C-F1～GST-GPC3CF4蛋白的结合情况，从而判定其表位结合情况。

2 结果

2.1 抗体辅助杀伤肝肿瘤的活性检测

依据上述分组及实验方法铺96孔细胞培养板，于5%CO2、37℃培养箱中培养72 h后，MTT法检测D490nm值。经统计学分析，抗体非特异毒性对照组与单独靶细胞组间D490nm值差异均无统计学意义（图1A），说明单独抗体对肝肿瘤HepG2细胞无直接杀伤作用；而各株抗体对应的ADCC杀伤组与效应细胞非特异杀伤组间D490nm值差异均有统计学意义（图1B），表明7株抗体均具有不同程度的辅助杀伤作用，其中以5号单抗的杀伤效果最好。

2.2 GPC3 C端的表位预测分析及重组表达

用生物信息学技术对GPC3 C端抗原表位进行分析，预测发现4个优势表位，其相应的位置和氨基酸序列见表2。

根据表位位置，将GPC3 C端截短为4个片段，分别为GPC3C-F1（359～425残基）、GPC3C-F2（426～472残基）、GPC3C-F3（473～525残基）和GPC3C-F4（526～580残基）。PCR扩增GPC3C-F1～GPC3C-F4编码基因，分别连接pMD18-T克隆载体，经序列测定后依据上述方法连接到pGEX-4T-1原核表达载体中，氨苄西林抗性选取单克隆菌落，扩增后提取质粒，用PCR方法进行鉴定，结果如图2所示，鉴定正确的质粒经测序后证明与GST正确融合且未发生序列突变（图3），提示GPC3 C端4个截短表达载体构建成功。

表2 GPC3 C端蛋白抗原表位预测分析结果

图1 7株抗体的ADCC活性检测

图2 pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3C-F4质粒的PCR鉴定

图3 pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3C-F4质粒的部分测序结果

将构建的pGEX-GPC3C-F1～pGEX-GPC3C-F4质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行重组表达，4种重组蛋白的大小均与理论值一致，且均以包涵体形式表达；大量诱导表达蛋白，采用切胶回收浸提的方法纯化，将重组蛋白分别命名为GST-GPC3C-F1～GST-GPC3C-F4。参见图4。

2.3 GPC3 C端单克隆抗体的识别表位分析

2.3.1 ELISA检测抗GPC3 C端单抗与不同重组截短蛋白的反应 将纯化的GST-GPC3C-F1～GSTGPC3C-F4蛋白作为抗原，以上述方法对7株抗GPC3 C端单抗进行间接ELISA检测，测量D450nm值，结果7株单抗体与GST-GPC3C-F1、-F2、-F4蛋白反应的D450nm最大值均小于0.2，且随稀释度的增加迅速下降到0.05以下（未显示结果），而7株单抗与GST-GPC3C-F3蛋白反应的D450nm最大值均大于0.3，且D450nm值随稀释度的增加而下降得不明显（图5），提示7株单抗均与GST-GPC3C-F3蛋白而不与GST-GPC3C-F1、-F2、-F4蛋白反应。初步说明GPC3C-F3含有7株单抗特异性识别的表位。

2.3.2 Western印迹分析抗GPC3 C端单抗识别的抗原表位 以Western印迹对7株抗体的识别表位进行进一步分析，结果见图6，7株单抗均特异性结合GST-GPC3C-F3，与ELISA结果一致。

上述2项实验充分说明，7株抗GPC3 C端单克隆抗体所识别的表位区为GPC3（473～525残基）的53残基长度的肽段，而且是线性抗原表位。

图4 SDS-PAGE检测GST-GPC3C-F1～GST-GPC3C-F4蛋白的表达及纯化

图5 间接ELISA法检测7株单克隆抗体的识别表位（以GST-GPC3C-F3为抗原）

图6 Western印迹检测抗GPC3 C端单克隆抗体的表位识别结果

3 讨论

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌的发病率及死亡率均位于恶性肿瘤的第二位。早期诊断、早期治疗对提高肝癌患者生存质量具有十分重要的意义。研究表明，GPC3与许多肿瘤的发生发展有关，可能是新的肝癌早期诊断标志物，同时GPC3还被作为肝癌免疫治疗靶点进行研究。Ishiguro等将GPC3 C端524～563残基片段免疫小鼠，筛选出产生的抗体与抗原具有高度结合特性的杂交瘤细胞克隆，获得了单克隆抗体GC33，发现该抗体可以抑制HepG2或Huh7移植小鼠模型的肿瘤生长，促进化疗药物对肿瘤的杀伤作用，其作用归功于ADCC作用，充分说明了抗GPC3抗体可能发展成为肿瘤治疗的一种手段。

为了寻找抗肝肿瘤更为有效，且具有自主知识产权的抗GPC3抗体，我们制备了7株抗单克隆抗体。为了检测这些抗体是否具有辅助杀伤肝肿瘤细胞的活性，我们以小鼠脾细胞为效应细胞、肝癌细胞HepG2为靶细胞，对7株单抗的ADCC作用进行了初步探索。结果显示，制备的7株单抗均具有不同程度的辅助杀伤作用。为了研究上述肿瘤抑制效果差异是否与其识别的蛋白表位不同有关，我们利用Goldkey软件分析了GPC3 C端的优势表位分布情况，并根据表位分析将GPC3 C端编码基因分为4个截短片段，通过PCR获得基因片段，经序列测定后，分别连接到原核表达载体pGEX-4T-1中，在宿主菌中大量表达和纯化了4种蛋白，用间接ELISA和Western印迹检测了GPC3 C端单克隆抗体的表位识别情况。结果显示，7株抗体均特异性结合含473～525残基的蛋白片段，是否识别473～525残基区域内的不同位置还有待于进一步研究。总之，经初步检测，我们前期制备的7株抗GPC3 C端单克隆抗体在细胞水平上均具有抗肝肿瘤活性，而且上述抗体所识别的表位为GPC3 C端的53个残基片段的线性表位。这些单抗在动物水平上是否具有抗肝肿瘤效果，尚待进一步的研究证实。

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