c-Fos不同结构域的真核表达及功能鉴定

付洁 ，王瑜 ，程龙 ，徐小洁 ，张浩 ，宋海峰 ，叶棋浓

军事医学科学院 a.生物工程研究所；b.放射与辐射医学研究所；北京 100850

激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）是一类由即刻早期应答基因编码的核转录因子，在哺乳动物中，AP-1主要由 Fos家族（c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2）和Jun家族（c-Jun、JunB和JunD）组成。AP-1蛋白以同源（Jun-Jun）或异源二聚体（Fos-Jun）的形式发挥转录激活作用。基础条件下，细胞中的AP-1以Jun同源二聚体为主，其表达水平和活性均很低；当细胞受到生理和病理因素刺激时，如细胞因子、生长因子、应激信号、感染、致癌剂等的刺激，细胞中的AP-1将以c-Fos和c-Jun异源二聚体为主，其表达水平和活性均迅速升高，激活下游信号转导通路，在多种肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥重要作用[1-2]。AP-1作为对外界信号发生反应的转录因子而且位于信号级联反应的末端，使外界信号和细胞功能之间建立起一定的联系，因此已作为抗肿瘤药物开发的重要靶标之一。

调节AP-1活性的方式目前主要有以下几个层面：二聚体的组成成分和量的不同，会在肿瘤发生发展的不同阶段起到致癌或抑癌的效果[3-4]；转录水平或翻译后水平的磷酸化修饰等调节方式[5-6]；蛋白质间相互作用，如与癌蛋白（RAS）或辅助蛋白（糖皮质激素受体GR或维甲酸受体RAR）等的相互作用也是调节AP-1转录活性的重要方式之一[7]。尽管已发现一些与AP-1相互作用的蛋白质，但只能部分解释肿瘤发生发展机制，且许多与AP-1相互作用的蛋白质的临床意义不清楚。由于AP-1在肿瘤发生发展中起极其重要的作用，因此与AP-1相互作用的新因子还在不断被发现。哺乳动物Fos家族中以c-Fos最重要，Fos家族在调节AP-1活性和肿瘤发生发展过程等方面具有重要作用[8-10]。

我们拟构建c-Fos蛋白的不同结构域片段的真核表达载体，并在293T细胞中表达，利用免疫共沉淀技术确定构建的结构域的正确性，为进一步研究与c-Fos相互作用的蛋白及其区域定位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人HEK293T细胞株由本实验室保存（用含10%热灭活小牛血清的DMEM培养基，培养于37℃、5%CO2细胞培养箱）；大肠杆菌DH5α、FLAG-pcDNA3.0载体由本实验室保存；LipofectAMINE2000转染试剂、DMEM培养基购自Invitrogen公司；小牛血清购自杭州四季青公司；限制性内切酶、DNA连接酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR回收试剂盒、显色液均购自康维世纪公司；预染蛋白marker购自Fermentas公司；琼脂糖珠偶联的抗FLAG抗体购自Sigma公司；抗FLAG和抗HA标签抗体、蛋白酶抑制剂cocktail均购自Sigma公司；扩增基因片段的PCR引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 c-Fos基因结构域划分及引物设计

以本实验室保存的FLAG-c-Fos（GenBank登录号为NM_005252）质粒为模板，根据文献[11]将c-Fos全长分为c-FosB、c-FosD和c-FosE等3个结构域片段（图1），用PCR技术设计引物（表1），将c-Fos分为3段结构域克隆到FLAG-pcDNA3.0载体中，酶切位点采用BamHⅠ和EcoRⅠ。因为构建的表达载体在3'端含有FLAG标签编码序列，因此将各结构域扩增片段后的终止密码子在引物中去掉，使目的蛋白与标签融合表达。

图1 c-Fos基因结构域划分模式图

表1 引物及序列

1.3 PCR程序和体系

参照PrimeSTAR HS DNA聚合酶说明书进行。在0.2 mL离心管中依次加入1 μL质粒模板、引物各0.5 μL（储存浓度 10 μmol/L）、5×PS缓冲液10 μL、dNTP 4 μL、0.5 μL PrimeSTAR 酶 ，用ddH2O将体系补足至50 μL。将上述混合液轻轻混匀，短暂离心。PCR反应程序：95℃ 10 min，然后以95℃ 20 s、55℃ 20 s、72℃ 1 min 进行 30 个循环，72℃ 7 min。取9 μL PCR产物，加入10×上样缓冲液1 μL，混匀，上样，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像仪验证条带是否正确。

1.4 FLAG-c-Fos不同结构域片段真核表达载体的构建

琼脂糖凝胶回收PCR产物，与FLAG-pcDNA3.0载体质粒分别用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，将酶切后的目的基因与载体DNA分别用1.5%和1%琼脂糖凝胶电泳回收，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂板后37℃温箱中倒置培养至长出克隆菌落。挑取克隆菌落放入5 mL含氨苄西林的LB培养基中，37℃、220 r/min振荡过夜培养，用质粒小量纯化试剂盒少量提取质粒。表达载体质粒经双酶切鉴定无误后，将样品送上海生工公司测序。

1.5 表达载体质粒的提取

将测序结果序列比对后，样品接入10 mL含有氨苄西林的LB培养基中，37℃、220 r/min振荡过夜培养，用Promega公司的质粒提取试剂盒提取质粒，紫外分光光度法测定浓度和纯度，D260nm/D280nm为1.8～1.9的质粒保存在-20℃待用。

1.6 细胞转染和收集

293T细胞用含10%胎牛血清、2 mmol/L谷酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液培养。将105细胞铺24孔板，次日细胞融合率约为70%时用LipofectAMINE2000转染试剂将1.5 μg FLAG-c-FosB、FLAG-c-FosD 和 FLAG-c-FosE质粒转染，转染后24～36 h以1000 r/min离心收集细胞，弃上清，用PBS洗涤一次，置冰上，加入1×SDS上样缓冲液，充分裂解细胞后行SDS-PAGE，Western印迹检测片段表达正确与否。

进行免疫共沉淀的转染实验，细胞培养条件同上，将106细胞铺35 mm直径的小皿，次日细胞融合率约为70%时用LipofectAMINE2000转染试剂将5 μgHA-c-Jun和 5 μgFLAG-c-FosB、FLAG-c-FosD、FLAG-c-FosE分别共转染，转染后24～36 h，以1000 r/min离心收集细胞，弃上清，用PBS洗涤一次，置冰上。

1.7 共转染蛋白分子的免疫沉淀

用0.5 mL预冷的细胞裂解液［1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）2 mL、5 mol/L NaCl 2.5 mL、NP-40 0.25 mL、0.5 mol/L EDTA 1 mL、蛋白酶抑制剂0.1 mL、1 mol/L DTT 0.1 mL，用 ddH2O 补至 100 mL］冰浴30 min后超声波裂解细胞，4℃、12 000 r/min离心，取适量上清与等体积2×SDS蛋白加样缓冲液混匀作为input，-70℃保存备用于免疫印迹分析。将其余上清转移到新的无菌管中，加入琼脂糖珠偶联的抗FLAG抗体，于4℃在旋转混合器上孵育结合4 h后用裂解液洗涤琼脂糖珠4次，每次4℃、3000 r/min离心3 min，洗涤完毕弃上清，向沉淀中加入30 μL 2×SDS蛋白加样缓冲液，-70℃保存备用于免疫印迹分析。

1.8 免疫沉淀标本的免疫印迹

将上述收集的免疫沉淀标本煮沸10 min变性，经10%SDS-PAGE分离，采用半干转印仪，以15 V恒压转印50 min，将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上，以含30 g/L脱脂奶粉的TTBS［100 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、9 g/L NaCl，0.1%Tween-220］室温封闭1 h，加1∶5000稀释的HA-HRP或FLAGHRP抗体室温孵育1 h，用TTBS洗涤后，用A/B液于X线胶片上曝光检测。

2 结果

2.1 c-Fos不同结构域的构建

c-Fos不同结构域片段的构建如图1，PCR扩增后获得c-FosB、c-FosD和c-FosE片段，分别为441、237、531 bp（图 2A），经酶切、连接、转化和挑取菌落，对重组质粒进行双酶切鉴定（图2B），将酶切正确的质粒送奥科生物公司测序，证实重组质粒构建正确（数据未示）。

2.2 c-Fos不同结构域的表达

将c-Fos不同结构域片段的表达载体转染293T细胞后，收集细胞进行Western印迹。c-FosB（147残基）、c-FosD（79残基）、c-FosE（176残基）的理论相对分子质量分别为 18×103、10×103、22×103，因连接有FLAG标签，表达产物比理论值略大（图3）。

2.3 HA-c-Jun和FLAG-c-Fos不同结构域片段的免疫共沉淀实验

免疫共沉淀方法检测到FLAG琼脂糖珠能将FLAG-c-FosB、FLAG-c-FosD和FLAG-c-FosE从细胞裂解液中沉降下来，并且在FLAG-c-FosD组可以特异性地检测到HA-c-Jun的存在（图4），说明本实验构建的FLAG-c-FosD可特异性地与HA-c-Jun结合，而FLAG-c-FosB、FLAG-c-FosE不与HA-c-Jun结合，这与文献报道的c-Fos和c-Jun形成异源二聚体依赖于bZIP区[16-17]相符。

3 讨论

蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中，包括复制、转录、翻译、细胞周期调控和信号转导等，特定蛋白质相互作用发生改变可以导致疾病的发生，因此，基于信号转导通路的关键蛋白进行与其相互作用蛋白的筛选，是新药研发的重要内容之一。在AP-1信号途径中，AP-1与其他蛋白质的相互作用是AP-1发挥功能活性的重要方式之一。这些与AP-1相互作用的蛋白不但能改变AP-1活性，而且其本身基因结构和/或表达水平在病理状态下也可能发生改变，因此这些相互作用蛋白也是药物开发的潜在靶标。

图2 c-Fos不同片段结构域的构建鉴定

图3 利用FLAG标签抗体对c-Fos不同结构域片段进行表达鉴定

图4 FLAG标签 c-Fos不同结构域片段与HA-c-Jun的免疫共沉淀

AP-1通过蛋白质间相互作用来发挥其功能至少有以下几种方式：①通过AP-1不同成员之间的相互作用调节AP-1转录活性。细胞中AP-1的组成和各组分的相对比例决定了AP-1的功能[3-4]。②通过AP-1与其他蛋白质的相互作用调节AP-1转录活性。如c-Jun或c-Fos可与一些Maf蛋白（v-Maf和c-Maf）相互作用形成异源二聚体；c-Fos还能与MafB、MafF、MafG和MafK相互作用，c-Jun则不能。通过这些相互作用，AP-1的功能大大增强[12-13]。一些调节蛋白也可通过与AP-1的相互作用抑制AP-1的功能。LaminA/C蛋白通过与c-Fos的相互作用改变c-Fos的亚细胞定位、抑制AP-1的DNA结合活性、抑制AP-1靶基因的转录激活，并导致细胞周期改变[14]。③AP-1通过与其他转录因子的相互作用调节AP-1或其他转录因子的转录活性[15]。如属于转录因子的雌激素受体（ER）可与AP-1相互作用并调节AP-1转录活性[6]，AP-1与转录因子Smad结合后可调节Smad介导的转化生长因子β（TGF-β）信号通路活性。因此，构建AP-1家族主要蛋白的不同结构域片段，对于研究其相互作用蛋白并进一步功能定位，具有重要意义。

哺乳动物细胞中，AP-1家族的主要成员为Fos和Jun家族，其中，c-Fos是Fos家族的最重要成员。根据现有文献报道[16-17]，c-Fos有多个结构域可以激活或调节转录，其中C端结构域有3个Fos激活分子（Fos activation modlues，FAM），其中2个FAM区含HOB1和HOB2基序，第三个FAM区含TBP结合基序（TBP binding motif，TBM），TBM的TBP结合活性可以被含有HOB1和HOB2的激活结构域放大；C-fos的N端含有一个抑制性结构域（inhibitory do⁃main，ID1），可作用于含有HOB1基序的FAM区，使之沉默；C-Fos含有碱性亮氨酸拉链（bZIP）的DNA结合结构域。我们希望获得可以和c-Fos相互作用的蛋白，因此并未对c-Fos的N端和C端的结构域进行细分，而只分为3个结构域。本研究中免疫共沉淀结果也表明，bZIP与c-Jun结合，从而佐证了c-Fos不同结构域构建的正确性。

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