转基因白桦不同月份叶片基因组DNA甲基化水平的变异

刘堃，曾凡锁，李博，詹亚光

东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040

甲基化是普遍存在于真核生物核DNA中的一种修饰途径[1]，在高等植物中主要发生在5mCG和5mCNG位点，其中5mCNG又以CAG、CTG和CCG为主[2]。DNA甲基化可通过抑制DNA（转座子）活性来保护基因组，也可通过引起基因沉默来调控特定内源基因的表达[3]。Shibukawa等[4]发现，DNA甲基化与胡萝卜胚胎发生转录因子C-LEC1表达的调控有关；夏兰芹等[5]发现，抗虫棉Bt基因表达量降低与35S启动子甲基化程度升高有关；王海海等[6]在对棉花的研究中证实了外源nptⅡ基因表达量与35S启动子甲基化程度的负相关性。由此可见，DNA甲基化在植物基因组防御、调控基因表达，以及控制植物的生长和发育中起重要作用[7-8]，对植物本身有着积极的意义，对外源基因的表达调控发挥着重要作用。木本植物相对于一年生草本植物，具有生长发育周期长、基因组庞大等特点。越来越多的研究也表明，树木无性和有性繁殖过程中伴随着广泛的表观遗传变异[9-10]，然而关于甲基化在木本植物发育过程中的调控机制及与外源基因表达的关系还不明确。因此，对树木生长发育过程中不同时间（如展叶初期、旺盛生长期、生长停滞及休眠期等）DNA甲基化水平和模式变化的研究，对于揭示树木生长发育阶段的转变的表观调控机制十分必要。

甲基化敏感扩增多态性（methylation-sensitive amplified polymorphism，MSAP）是 Reyna-López等[11]在对真菌的研究中首次提出的使甲基化差异可视化的一种研究手段，是在扩增片段长度多态性（AFLP）基础上建立起来的一种新技术，近年来被广泛应用于拟南芥[12]、玉米[13]、橡胶[14]等植物的研究中。其原理是，用对甲基化敏感程度不同的2个同裂酶HpaⅡ和MspⅠ（识别5'-CCGG位点）分别与EcoRⅠ组合后对DNA进行双酶切，产生长度不等的片段，然后在酶切片段两端连接接头，根据相应接头设计特异性引物对酶切片段进行扩增，其他遵循标准AFLP分析，经聚丙烯凝胶电泳分离显色后对比同一位置2组酶切条带的有无，即可判断甲基化与否。

我们以转bgt抗虫基因的白桦为实验材料，对其不同月份DNA甲基化水平及外源基因表达水平进行分析，探索DNA甲基化对植物发育的影响及其与外源基因表达的关系，从而为阐述DNA甲基化的相关机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

农杆菌介导法获得的转bgt抗虫基因白桦（Betu⁃la platyphylla Suk.）及非转基因对照栽植于本校白桦强化育种基地，在自然条件下生长，于展叶初期、旺盛生长期及生长停滞期（5～9月）分别取转基因白桦的叶片，液氮冷冻，-80℃保存。工程菌为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，双元载体系统，其中的质粒pYHY（13.9 kb）携带抗虫基因（蜘蛛杀虫肽基因与Bt基因C肽的嵌合基因，简称bgt基因）、nptⅡ基因和gus基因[15]。

1.2 白桦DNA-MSAP体系的建立及引物筛选

采用改良的CTAB法提取基因组DNA[16]。选用限制性内切酶EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ组合分别对基因组DNA进行双酶切［酶切体系：10×NEB缓冲液 5 μL，DNA 40 μL（不多于 2 μg），HpaⅡ/MspⅠ 1.25 μL，EcoRⅠ 2.5 μL，ddH2O 1.25 μL］，37℃过夜酶切，加入 2 μL RNase（10 μg/mL），37℃消化1 h，除去多余的RNA。取酶切产物5 μL，加入10×T4DNA连接酶缓冲液2.5 μL、EcoRⅠ adapt⁃er 1 μL、H-M adapter 1 μL、T4DNA连接酶1 μL、ddH2O 14.5 μL，短暂离心，16℃过夜反应。

PCR反应体系包括连接产物5 μL、引物E00和H-M00（10 μmolo/L）各 1 μL、Taq酶 0.3 μL、10×缓冲液 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 8.7 μL。预扩增程序：94℃ 3 min，以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 90 s进行30个循环，72℃ 7 min。预扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测，-20℃保存备用。

对表1中选择性扩增引物进行组合，并以梯度PCR扩增，筛选合适的引物组合。梯度PCR体系为稀释至 1/10的预扩增产物 2 μL、引物（10 μmol/L）各 1 μL、Taq酶 0.3 μL、10×缓冲液 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 11.7 μL。 反 应 程 序 ：94℃ 3 min，以94℃ 30 s、65℃ 30 s（每次循环降低 0.7℃）、72℃90 s进行12个循环，以 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃90 s进行22个循环，72℃ 10 min，4℃保存。反应产物经2.5%琼脂糖凝胶和6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，选择条带较多的引物组合进行后续实验。

选择性扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以75 W恒定功率预热1 h。选择性扩增产物与上样缓冲液以5∶1的比例混合后于95℃变性5 min，立刻置于冰上，冷却后点样，75 W恒定功率电泳，待溴酚蓝完全跑出胶板后停止电泳，冷却10～15 min，银染显色。

1.3 甲基化水平测定

按照上述建立的方法对不同月份转基因白桦叶片基因组DNA进行检测。在电泳图谱上2条泳道分别为HpaⅡ/EcoRⅠ组合和MspⅠ/EcoRⅠ组合酶切后所得条带。根据泳道内条带的有无将条带类型分为3种：Ⅰ，二者均有带，表明该位点没有甲基化；Ⅱ，前者有带后者无带，表示半甲基化位点；Ⅲ，后者有带而前者无带，表示全甲基化位点。分别统计同一样本不同引物组合条件下各类型条带数量，有带记为“1”，无带记为“0”。半甲基化比率=Ⅱ/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）×100%，全甲基化比率=Ⅲ/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）×100%，甲基化多态性=（Ⅰ+Ⅱ）/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）×100%，从而对甲基化变化水平进行测定。

表1 MSAP分析的接头和引物序列[17-18]

1.4 转基因白桦外源基因表达量检测

转基因白桦叶片总RNA的提取采用缓冲液冰浴-CTAB法[19]。取少量用于琼脂糖凝胶电泳，其余存放于-80℃冰箱中备用。参考DIG DNA Label⁃ing and Kit试剂盒说明书方法标定bgt基因探针，对不同月份转基因白桦叶片中外源基因的表达量进行检测。Northern杂交采用甲醛变性胶电泳，虹吸法过夜转膜，42℃杂交6～8 h。其他操作参照文献[20]。

2 结果

2.1 白桦DNA-MSAP体系的建立

2.1.1 基因组DNA的提取与纯化 用改良CTAB方法提取不同月份转基因白桦叶片基因组DNA的结果见图1，条带清晰，点样孔干净，没有拖尾现象，纯度和量都能满足后续实验。

2.1.2 基因组DNA混合双酶切 用HpaⅡ和EcoRⅠ、MspⅠ和EcoRⅠ两种内切酶组合对白桦叶片基因组DNA进行酶切（图2）。酶切效果很好，弥散状的条带说明酶切彻底，可进行后续实验。

图1 白桦基因组DNA提取电泳图谱

图2 白桦基因组DNA混合双酶切电泳图谱

2.1.3 引物筛选 针对3条H-M引物和10条EcoR引物组合成30对引物组合，分别对预扩增产物进行选择性梯度PCR扩增，结果不同引物组合所扩增出的条带数差异显著，条带较多，说明扩增效果较好。根据扩增结果（表2）筛选出的7对引物组合为E02/H-M01、E03/H-M01、E09/H-M01、E07/H+M02、E08/H-M02、E08/H-M03、E09/H-M03。

2.1.4 白桦基因组DNA-MSAP体系的确定及聚丙烯酰胺凝胶电泳 用对甲基化敏感程度不同的2种内切酶建立了研究白桦基因组甲基化水平变化的DNA-MSAP实验体系。选择性扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，结果每条泳道条带清晰可辨，每对引物组合都有大量差异条带，信号强度可靠（图3）。因此，该体系可用于白桦基因组DNA甲基化水平差异研究。

2.2 不同月份转基因白桦叶片DNA甲基化水平分析

2.2.1 不同月份转基因白桦叶片DNA甲基化模式分析 选用7对引物对不同月份转基因白桦叶片基因组DNA甲基化状态进行了检测，每对引物组合都获得了清晰的条带。如图3所示，根据HpaⅡ对内部胞嘧啶甲基化（CmCGG）敏感而MspⅠ对外部胞嘧啶甲基化（mCCGG）敏感的特性，酶切后在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上特定CCGG位点带型可分为3种模式：Ⅰ，HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ组合均有带，这种情况在图谱上最为常见，所占比例为66.82%，表示CCGG位点没有甲基化；Ⅱ，HpaⅡ/EcoRⅠ组合有带而MspⅠ/EcoRⅠ组合没有带，这种模式占17.99%，表示半甲基化位点；Ⅲ，HpaⅡ/EcoRⅠ组合没有带而MspⅠ/EcoRⅠ组合有带，这种情况表示该位点是全甲基化位点，占全部扩增片段的15.19%。在扩增获得的856条条带中，共包含甲基化位点条带284个，甲基化比例为33.12%。

2.2.2 不同月份转基因白桦叶片DNA甲基化状态分析 选用扩增条带较多的7对引物对转基因白桦不同月份叶片基因组DNA甲基化动态变化状况进行分析，结果见表3。在5～9月的5个样品中检测到的总扩增条带依次为164、162、181、186和163，其中总甲基化带数依次为 36、48、46、77和 77，甲基化多态性依次为21.95%、29.62%、25.41%、41.39%和47.24%。在不同月份样品中，Ⅱ、Ⅲ类条带出现比例相差较大，其中，5～9月叶片DNA半甲基化比例依次为10.37%、19.14%、14.92%、17.20%和28.38%，全甲基化比例依次为11.58%、10.49%、10.50%、24.19%和18.40%。由此可见，叶片在同一年的生长发育过程中甲基化水平处于动态变化中，除7月稍有波动外，整体上呈现随着叶片的衰老逐渐升高的趋势。

表2 30对引物组合扩增结果

图3 选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

2.3 外源基因在不同月份的表达差异

用缓冲液冰浴-CTAB法提取转基因白桦叶片总RNA（图4），条带清晰，28S条带亮度明显高于18S条带，经检测，RNA质量达到Northern印迹要求。

选取表达稳定的转基因白桦无性系，应用Northern杂交分析叶片中外源基因不同月份的表达差异。采用紫外分光光度法定量结合琼脂糖凝胶电泳来决定各样品总RNA的杂交用量，每孔点样20 μg。结果显示（图5），同一无性系在一年中的5～9月份间，5～7月表达量最高，8～9月呈下降趋势，这与虫害发生时期同步，因此对抗虫、保护植株具有重要作用。同时，对比外源基因表达情况和甲基化状态变化模式可发现，在基因组DNA甲基化水平相对较低的5月，外源基因的表达量相对较高，而在甲基化水平较高的8月，外源基因却处于表达量相对较低的状态。由此可见，外源基因的表达量与基因组DNA甲基化状态呈负相关趋势。

表3 不同月份转基因白桦叶片DNA甲基化带型统计分析

图4 转基因白桦总RNA电泳图谱

图5 转基因白桦中不同月份bgt基因表达的Northern杂交图谱

3 讨论

MSAP技术近年被广泛用于拟南芥[12]、水稻[21]、棉花[22]和苹果[23]等植物基因组的胞嘧啶甲基化分析，具有可靠、高效等优点。该技术成败的关键在于酶切效果，而基因组DNA的质量直接影响酶切效果，因此获得高质量的基因组DNA是MSAP技术分析的关键节点。白桦叶片中含有大量与DNA性质极为相似的多糖，从而影响了基因组DNA的提取，而我们采用缓冲溶液短暂冰浴法将多糖降低到较低水平，可满足后续实验要求。对连接产物进行预扩增，可实现模板DNA的选择性纯化，增加目标DNA片段的数量，为选择性扩增提供充足的DNA保障。我们在试用的30对引物组合中选出7对条带多态性较高的组合进行选择性扩增，能够有效反映不同月份叶片基因组DNA甲基化状态，这对揭示叶片不同发育阶段表观遗传状态变化水平具有重要意义。

本研究中平均甲基化位点比例为33.12%，符合前人在植物研究中得到的MSAP对基因组DNA甲基化的检出率为4.5%～45%的规律[24-26]，与之前对福松（30%～60%）[10]、苹果（25%）[23]、杉木（42%～79%）[27]和橡胶（22.9%～33.2%）[28]等木本植物基因组DNA甲基化的检出率不同，这体现了基因组DNA甲基化修饰水平在不同物种间的差异。受HpaⅡ和MspⅠ识别位点的限制，本研究只反映了部分CG或CCG位点的甲基化状态，整个基因组的甲基化水平可能略高于本实验结果，但CG和CCG是高等植物中的主要甲基化位点[2]，故CCGG位点甲基化状态能够相对客观地反映植物基因组甲基化修饰水平。本研究表明转基因白桦成熟叶片DNA甲基化水平显著升高，这说明在叶片的发育过程中伴随着DNA甲基化状态的改变，这与Fraga等对福松不同发育阶段甲基化程度的研究结果相似，幼年的DNA甲基化水平为30%～35%，成熟的为60%[10]。而Baure等在对桃树研究中发现幼嫩叶片的DNA甲基化水平为22.4%，成熟叶片为20.7%[29]。可见DNA甲基化水平在不同植物发育过程中的变化趋势不同。这些结果表明DNA甲基化程度变化可能与叶片的发育过程相关，但是促使叶片发育的原因还是叶片发育的结果还有待进一步研究。李旭刚等发现，启动子区域的甲基化阻断了外源uidA基因的转录，最终导致该基因失活[30]；Duan等的研究表明，CMV启动子的高度甲基化导致绵羊体细胞内外源fat-1基因的沉默[31]。可见甲基化在对外源基因表达的调控方面发挥着重要作用。我们对白桦外源基因表达情况的研究表明，在同年5～8月间外源基因的表达状态与甲基化水平呈负相关趋势。这与夏兰芹等的研究结果相似，Bt基因在抗虫棉生长发育后期表达量降低与35S启动子甲基化程度升高有关[5]。此外，谭双香等的研究证明，甲基化是导致鼻咽癌细胞系膜联蛋白A1基因表达下调的主要原因[32]。综合以上研究结果可以得出结论，转基因白桦DNA甲基化水平的升高影响了外源基因的转录，终致其表达水平降低。

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