一种用于流感病毒亚单位疫苗纯度分析的改进方法

田文莉 ，邵铭 ，祁骥 ，刘淑珍 ，谷堃 ，李长贵 ，杨旭 ，李小强

1.天士力金纳生物技术（天津）有限公司，天津 300410；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050

流感病毒表面散布着几种形态不一的蛋白突起，其中含量最多的是血凝素（haemagglutinin，HA），它是流感病毒感染宿主细胞的关键蛋白[1]，也是流感病毒亚单位疫苗中有效的免疫原性物质[2-4]。在组成流感病毒的所有蛋白质中，HA约占总蛋白量的30%，核蛋白（nucleocapside protein，NP）次之，占总蛋白量的25%左右。基质蛋白（matrix protein，M）包括M1和M2，M1是病毒粒子中最丰富的一种多肽。HA分子由重链（HA1）和轻链（HA2）组成，由一个精氨酸（Arg）残基相连，同时具有若干个糖基化位点，糖基化位点的数目和位置随毒株不同而异[5-7]。

肽N-糖苷酶F（PNGase F）是一种酰氨酶，可以在N-糖蛋白的高甘露糖、杂合和复合寡糖部分最内侧的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基之间进行切割，几乎可以水解糖肽/糖蛋白中所有N-聚糖链[8-9]。

由于糖蛋白在还原型SDS-PAGE中的迁移率不同于无糖基化的蛋白质[10]，因此我们拟采用PNGase F对不同型别的流感病毒亚单位疫苗中间体进行了去糖基化处理，消除了血凝素亚基糖基化对电泳迁移率的影响，使样品中不同组分的蛋白质得到了更好的分离，从而提高了对杂质的分辨力。

1 材料与方法

1.1 材料

流感病毒亚单位疫苗超离中间体（ultracen⁃tri-fugation intermediate）为疫苗生产过程中经蔗糖密度梯度离心分离得到的产物，主要成分为HA，由天士力金纳生物技术（天津）有限公司生产。H1N1亚型流感病毒毒株为NYMC X-181 reassortant de⁃rived from A/California/7/2009，H3N2亚型毒株为IVR-155 reassortantderived from A/Victoria/210/2009。

本研究以疫苗生产过程中经蔗糖密度梯度离心分离的杂质峰（简称超离杂峰，ultracentrifugation impurity peak）为对照样品，由天士力金纳生物技术（天津）有限公司生产技术部提供。该样品除含有少量HA外，还含有流感病毒颗粒中的其他蛋白质成分，其毒株来源与对应的疫苗中间体样品相同。

PNGase F购自New England Biolabs（500 000 U/mL）；糖苷酶贮存液［50 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5 mmol/L Na2EDTA，50% 甘油］；SDS-PAGE用试剂购自Sigma公司；SDS-PAGE低分子量蛋白质marker由中国科学院上海生物化学研究所监制；染色液（0.25%考马斯亮蓝R250溶于脱色液中）；脱色液（无水乙醇∶冰醋酸∶水=9∶9∶2）。

1.2 去糖基化处理

将样品稀释至总蛋白浓度约为1000 μg/mL，参照文献[11-12]所述方法取稀释后的样品36 μL，加入10×Glycoprotein Denaturing Buffer 4 μL，混匀后100℃水浴10 min，使蛋白质变性；冷却至室温后分别加入 10×G7 Reaction Buffer 5 μL、10%NP-40 5 μL及50 000 U/mL的PNGase F（以糖苷酶贮存液进行1/10稀释）1 μL，混匀后37℃水浴过夜（约16 h）。

1.3 SDS-PAGE

分别取36 μL未经处理样品加入15 μL PBS（使其与处理后的蛋白浓度一致），作为去糖基化处理前的对照。向去糖基化处理前和处理后的样品管中分别加入6×还原型上样缓冲液10 μL，混匀后100℃水浴5 min，冷却至室温后上样。

图1 H1N1亚型样品去糖基化处理前、后的SDS-PAGE

采用Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳装置进行实验，聚丙烯酰胺电泳凝胶（丙烯酰胺单体与N，N'-甲叉双丙烯酰胺单体的比例为37.5∶1），浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。每孔上样15 μL，浓缩胶60 V、分离胶120 V，恒压电泳，待染料迁移至凝胶边缘时终止电泳，取出凝胶进行固定、染色、脱色、成像。

2 结果

2.1 H1N1亚型中间体杂质分析

取H1N1亚型超离中间体和超离杂峰去糖基化处理前、后的样品进行SDS-PAGE，结果见图1。由泳道1、2条带可以看出，糖基化的HA1与NP的电泳条带重合，去糖基化处理后可以清楚地区分这2个蛋白；HA2在去糖基化后也能观察到其电泳迁移率的改变。由泳道3、4可以看出，H1N1亚型超离中间体样品去糖基化后仍然只能观察到HA1和HA2蛋白条带，说明该样品的血凝素纯度很高，几乎不含其他蛋白。

其中，第2泳道的超离杂峰样品在去糖基化处理时加入的是未经稀释的糖苷酶，图中可见相对分子质量为36×103的糖苷酶条带；而第4泳道的超离中间体样品则使用稀释后的糖苷酶，其含量低于考马斯亮蓝染色的检测限。

2.2 H3N2亚型中间体杂质分析

取H3N2亚型超离中间体和超离杂峰去糖基化处理前、后的样品进行SDS-PAGE，结果见图2。可以看出，经去糖基化处理后，HA1和HA2的迁移率均有明显改变。第1泳道超离杂峰样品未经去糖基化处理前M蛋白与HA2的电泳条带紧密相邻难以分辨，经去糖基化处理后2种蛋白即可被清楚地区分。此外，泳道4超离中间体样品去糖基化后仍然只能观察到清晰的HA1和HA2条带，说明该样品血凝素纯度很高。

图2 H3N2亚型样品去糖基化处理前、后的SDS-PAGE

3 讨论

流感病毒亚单位疫苗的生产，首先是用各型别的毒种分别接种鸡胚以制备大量的流感病毒；然后将病毒裂解，通过蔗糖密度梯度超速离心获得以各型别HA为主要成分的超离中间体，再经柱纯化后得到各型别的单价原液；最后将规定型别、经检验合格的单价原液按照一定的HA浓度混合制得流感病毒亚单位疫苗[13]。其中，蔗糖密度梯度离心是HA和其他杂质蛋白的分离中最直接、最关键的步骤，因此超离中间体中HA的含量及纯度就直接关系着流感病毒亚单位疫苗质量的优劣。

在本研究中，我们以生产过程中分离到的杂质样品作为对照，研究和分析了不同型别流感病毒亚单位疫苗的中间产品，针对血凝素是糖蛋白的特性对其进行去糖基化处理，然后再以还原型SDS-PAGE来分析，显著提高了纯度分析的分辨力。

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