牦牛肠道粪肠球菌的分离和鉴定

周雪雁，刘翊中，陈轶霞，李 倬，刘俊林

(西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124)

肠球菌(Enterococcus)属于链球菌科肠球菌属，是人类和动物肠道正常菌群的一部分，其数量仅次于大肠埃希菌。1989年，依据 Facklam和Collins［1］的分类，肠球菌属内包括12个种及1个变异株，按照其利用糖类的特征可将肠球菌分为3组:第1组以鸟肠球菌(E.avium)为代表;第2组以粪肠球菌(E.faecalis)为代表;包括屎肠球菌(E.faecium)等;第3组以坚韧肠球菌(E.durans)为代表。粪肠球菌又叫粪链球菌，是肠球菌属的模式种，为条件致病菌，当抗生素大量使用或宿主免疫力低下时，会引起感染性疾病的发生发展［2］。但粪肠球菌很多正常的生理特性是有益的，对维持肠道正常菌群结构发挥着重要作用［3］。早期对于粪肠球菌的分类和鉴定主要依靠形态学特征、培养特性、生理生化反应试验和免疫学反应进行［4］。随着分子生物学的飞速发展，特别是聚合酶链式反应技术(PCR)的发明，其中16S rRNA基因的序列同源性分析，建立细菌系统发育树已经成为细菌种属鉴定的标准方法，在细菌的分类研究中起着重要的作用。目前大约2500个种的16S rRNA全序列已经被报道。根据它们的序列同源性，已经构建了各种属的系统发育树［5］。本试验通过分离纯化培养、生理生化反应试验及16S rRNA序列分析法对分离菌株进行了初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集及处理 本试验的样品来源于甘肃天祝散养健康白牦牛的新鲜粪样。样品无菌采集后尽快接入粪肠球菌选择性培养基中，置于厌氧条件下培养。

1.1.2 主要培养基与试剂 粪肠球菌选择性培养基(质量分数，g):蛋白胨10，麦芽糖20，酵母浸粉10，甘油磷酸钠10，氯化钠5，乳糖1，溴甲酚紫0.015，叠氮钠 0.4，TTC 0.1，琼脂 13，加热溶解于1 L 蒸馏水中，pH 值 7.2 ±0.2，煮沸 5 min，冷至50℃左右，倾入无菌平皿，备用。明胶基础培养基、单糖发酵培养基、硝酸盐还原试验培养基、蛋白胨水培养基(吲哚试验)、葡萄糖蛋白胨水培养基(甲基红试验)，柠檬酸盐培养基、醋酸铅琼脂培养基7种鉴别培养基，革兰染色液、3% ～15%H2O2、1.6 g/100 mL 溴甲酚紫、格里斯氏试剂(A、B液)、二苯胺试剂、碘液、甲基红试剂等。

1.2 方法

1.2.1 待测菌株的分离纯化 ①样品稀释:在无菌条件下，用无菌移液管吸取1 mL混合均匀的液体样品，加入装有三蒸水的试管中，将其混合均匀，制成 10－1稀释液;②涂布:将 10－1稀释液1 mL接入粪肠球菌琼脂培养基中，用涂布棒将菌液涂布均匀;③培养:将接种好的平板培养基倒置于厌氧罐中，37℃厌氧培养，2～4 d后观察生长的菌落，用于进一步分离纯化。通过以上样品稀释液的分离培养，从生长的菌落中挑取单菌落于粪肠球菌琼培养基上进行2～3次纯化［6］。

1.2.2 分离菌株的鉴定 ①菌落形态与染色特征观察:挑取分离纯化的单菌落再次划线接种于固体培养基平板上，厌氧培养48～72 h后，进行菌落形态观察，并记录该菌的菌落形态特征。挑取培养48～72 h的菌落涂片，革兰染色并镜检，观察菌体形态和颜色。将初步鉴定为肠球菌的菌落接种于液态培养基中，进行厌氧增菌培养，以便下一步生化试验鉴定［7］;②生化试验鉴定:将接种于液体培养基中的分离菌进行生化反应特性测试。生化反应包括接触酶试验、明胶液化试验、吲哚试验、甲基红试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐试验、葡萄糖反应、乳糖反应、果糖反应、半乳糖反应、蔗糖反应、木糖反应、纤维二糖反应、核糖反应等生化特性鉴定。试验结果对照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)进行综合判定［8］;③分子生物学鉴定:a.16S rRNA PCR扩增:裂解菌体细胞，PCR反应模板的获取:取50 μL Lysis Buffer FOR Microorganism to Direction PCR TaKaRa code No.D304于灭菌的Microtube中。用灭菌牙签或枪头挑取单菌落(将分离菌株划线于粪肠球菌琼脂培养基，培养48 h)，置于Microtube中搅动几下后取出，80℃热变性15 min后低速离心，取1～5 μL裂解后的上清液作为PCR反应的模板。

表1 16S rRNA PCR反应体系Table 1 16S rRNA PCR reaction system

引物序列:1492R:5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(Y，M为简并碱基分别代表 C/T，A/C)。PCR的反应条件:94℃预变性7 min，循环从94℃变性1 min开始，50℃退火1 min，最后在72℃延伸1.5 min结束，30个循环;最后72℃、10 min充分延伸。取9 μL扩增产物进行电泳，并用分子量为DL2000 Marker作参照，电压为100 V，琼脂糖凝胶为1%，用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照［9］;b.16S rRNA 基因扩增产物的序列测定:按PCR产物纯化试剂盒说明对扩增产物进行回收。将切胶回收纯化的扩增产物直接送上海生物工程技术服务有限公司完成测序。测定的DNA序列以双链碱基互补的结果为准;c.16S rRNA基因序列分析:将所测分离株的16S rRNA基因序列与GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已登录的相关序列(表2)进行同源性分析，利用DNAstar软件中MEGA5.0绘制系统发育进化树［10］。

表2 16S rRNA序列比对中应用的相关序列Table 2 The 16S rRNA gene sequences used in sequence alignment

2 结果与分析

2.1 分离菌株的菌落特征

将培养了2～4 d的菌落进行观察，在粪肠球菌选择性培养基上的菌生长旺盛，菌落特征一致为圆形，边缘整齐，表面光滑，扁平隆起，呈现有乳白色、不透明，白瓷瓦状，菌落大小1～2 mm，黏稠湿润。如图1所示，该菌株命名为M.D.E1。

图1 分离菌的培养结果Fig.1 Culture lones of the isolates

2.2 分离菌株的革兰染色结果

通过革兰染色并镜检，观察到所分离的菌为阳性菌，形态为球形、椭圆形，呈单个、成对或短链状排列，无鞭毛、无芽胞。如图2所示。

图2 分离菌的革兰染色结果Fig.2 Gram staining result of the isolates

2.3 分离菌株的生化鉴定结果

将待测菌株M.D.E1通过生化试验测定，其具体试验结果见表3和表4。分离株的生化鉴定结果与标准肠球菌株结果相符。

表3 16S rRNA序列比对中应用的相关序列Table 3 The biochemical reaction results of M.D.E1

表4 M.D.E1的生化试验(糖发酵试验)结果Table 4 The sugars fermention test results of M.D.E1

2.4 分离菌株16S rRNA基因扩增结果

凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。扩增产物经电泳可见16S rRNA基因在约1500 bp处有1条特异性亮带，与预期片段大小相符(如图3所示)。

图3 16S rRNA的PCR扩增产物电泳图结果Fig.3 The agarose gel electrophoresis results of the 16S rRNA PCR amplification products

2.5 分离菌株16S rRNA序列比对结果及系统发育进化树的构建

分离菌株的16S rRNA测序结果为1544 bp;由于是PCR产物直接测序，经Blast比对，尽可能把拼接后的不可靠序列删去，因此长度基本与预期相符。序列比对得到的打分矩阵如图4，打分矩阵清晰地显示了菌株M.D.E1与GenBank提交的粪肠球菌相似性都大于97.5%，通常认为2条16S rRNA序列的相似性大于97.5%则认为这2条序列来源的物种为同一物种［5］。所以可以推定菌株M.D.E1为粪肠球菌。菌株M.D.E1的系统发育进化树如图5，由进化树可以看出菌株M.D.E1与粪肠球菌的分化距离较短(Nucleotide Substitutions=60)。

图4 分离菌M.D.E.与相关菌的16S rRNA基因间同源性打分矩阵Fig.4 The sequence homology distances of 16S rRNA genes between the isolated M.D.E1.and related bacteria

图5 分离株M.D.E.与代表性粪肠球菌的16S rRNA基因进化树Fig.5 Bootstrapped neighbour joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene of isolated M.D.E1.

3 讨论

粪肠球菌属于需氧或兼性厌氧菌，本试验利用厌氧罐进行厌氧培养以达到分离的目的。采用实验室传统纯培养和生化试验方法，鉴定粪肠球菌会存在一定程度的误差，本试验通过16S rRNA测序构建了16S rRNA进化树，分离株与其他参照粪肠球菌在一个大分支中，且在同源性分析中，同源率大于97.5%。传统的生理生化方法及16S rRNA系统进化分析，只能初步确认该分离株为粪肠球菌。进一步鉴定需要通过DNA杂交和脉冲场电泳技术［11］，最终应将待测菌株的全基因组序列与标准株全序列进行比对才能做出准确鉴定［12］。尽管粪肠球菌是人和动物正常菌群之一，但它为条件致病菌，可以引起尿路感染、化脓性腹部感染、败血症、心内膜炎和腹泻发烧等多种疾病。据报道肠球菌是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠埃希菌［13］。而且研究表明肠球菌还极易形成耐药性，表现为氨基糖甙类耐药，耐β-内酰胺类及糖肽类，耐万古霉素等，在临床分离的肠球菌中有许多是多重耐药菌株［14］。另外，很多分离菌株，能产生一种叫肠球菌素(Enterocin)的细菌素，对单增李斯特菌和其他乳酸菌有杀灭作用［15］。美国研究人员 Moore DR 等［16］研究表明粪肠球菌能产生有害化学物质，破坏DNA，进而引起促发直肠癌的基因活动。因此，将粪肠球菌作为益生菌存在争议，国际益生菌产品协会(International Probiotics Association)和世界卫生组织(WHO)均建议:益生菌中不宜使用肠球菌［17］。但国内仍有公司在生产粪肠球菌作为饲料添加剂，有关粪肠球菌的生理特性、作用及用途还有待于国内外学者进一步探讨和研究。

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