异型流感病毒感染相关T淋巴细胞增殖活性及IFN-γ阳性T淋巴细胞水平研究

原 野，杨 松，薛 坤，刘思楠，邹婷婷，金 红

(中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110001)

流行性感冒病毒(influenza virus)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分为甲、乙、丙3型。甲型流感病毒常常感染人并导致严重疾病，在人群中迅速传播，成为威胁人类健康的常见病原体之一。由于流感病毒是分节段的RNA病毒，容易发生错配的RNA依赖的RNA聚合酶和基因重组导致抗原漂移和抗原转换，尤其是表面糖蛋白抗原-血凝素(hemagglutinin，HA)最易发生变异，使流感在人群中不断形成流行［1］。2009年A/H1N1型流感的爆发再次引起全球的关注［2］。目前使用的抗流感疫苗只含几种常见流行株，主要是诱导机体产生HA特异性中和抗体，只对所含型别有效，对预防变异株感染无效。世界卫生组织根据每年流感流行情况，对疫苗组合进行调整，而疫苗的研制常常滞后于流感病毒抗原的变异。所以，研发可以抵御多种流感病毒感染，减轻感染的严重性并且在爆发时限制疾病的传播的“通用型”疫苗成为对科学界的挑战［3］。流感病毒感染诱导产生以系统和局部抗体反应为代表的特异性体液免疫以及以特异性T细胞反应为代表的细胞免疫，二者对宿主抗病毒感染都很重要。因为针对疫苗产生的特异性抗体，不能阻止已发生变异的流感病毒感染，研究人员开始考虑能否通过提高细胞免疫的方法，达到预防异型流感病毒感染的目的。哪种细胞免疫反应在抗异型流感病毒免疫中起主要作用，其机制是什么，目前无统一的结论。我们在前期研究中发现，异型流感病毒间存在部分交叉保护作用，而且IL-2可以提高异型流感病毒感染组的生存率。为探讨其机制，本研究重点研究异型流感病毒感染前后病毒载量，T淋巴细胞增殖活性和IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞及IFN-γ阳性CD3+CD4+淋巴细胞水平的变化。希望能为制备“通用型”流感疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8周龄SPF级C57BL/6小鼠，雌性。

1.1.2 病毒 A/FM/47(H1N1)流感病毒株，由中国医科大学病原生物学实验室提供，用鸡胚进行增毒及病毒滴定。

1.1.3 试剂 A/H5N1流感病毒全疫苗(辽宁益康生物制品有限公司);Trizol(invitrogen);TaKaRa PCR试剂盒;MTT试剂(碧云天);Foxp3 Staining Buffer Set(EBioscience);抗体(Becton Dickinson公司)等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 实验1组(同型组):用 A/H1N1型流感病毒免疫，A/H1N1型流感病毒感染;实验2组(异型组):用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，A/H1N1型流感病毒感染;实验3组(异型加强型组):用A/H5N1型流感病毒疫苗+IL-2免疫，A/H1N1型流感病毒感染;对照1组:用PBS代替疫苗，A/H1N1型流感病毒感染;对照2组:只注射IL-2，再感染A/H1N1型流感病毒;对照3组:正常饲养，不做任何处置。

1.2.2 感染及免疫动物 实验1组(同型组)以半数鸡胚感染量EID50为103的A/H1N1流感病毒50 μL鼻腔接种免疫;实验2组和实验3组(异型组和异型加强组)A/H5N1型疫苗接种按说明书进行，每只小鼠鼻腔接种50 μL;应用IL-2组参照文献［4］及试剂说明书，使用疫苗的同时经腹腔注射 rIL-2，0.3 mL(1 万单位)连续注射 0、1、2 d。首次免疫3周后加强免疫1次，方法剂量同上。加强免疫2周后，按上述分组每只小鼠经鼻腔感染 EID50为104.8的 A/H1N1流感病毒 100 μL。正常饮食饮水饲养，感染病毒后每天准确称量小鼠体重，观察饮食饮水及精神状态。

1.2.3 Real-Time RT-PCR 法测定病毒量 感染病毒后5 d取肺，研磨肺组织，用Trizol提取RNA，按照TaKaRa PCR试剂盒说明书进行cDNA合成，用ABI-C500 PCR仪进行检测。5'-CTGAGAAGCAGGTACTGGGC-3'(有义链)和 5'-CTGCATTGTCTCCGAAGAAAT-3'(反义链)为本实验选用的引物。

1.2.4 MTT法测定T淋巴细胞增殖活性 分别于感染前、感染后5、7 d无菌解剖小鼠取脾，常规分离脾细胞;调节细胞浓度至5×106/mL，加至96孔板中，100 μL/孔，每个测试设定3个复孔，同时设置阴性空白对照孔;分别加入含5 μg/mL ConA的完全 RPMl-1640培养液100 μL/孔，置37℃，5%C02培养箱孵育68 h;各孔吸出100 μL上清，按照MTT试剂盒说明书进行;酶标仪570 nm处测定各孔A值。

1.2.5 流式细胞术测定 IFN-γ 阳性 CD3+CD8+/CD4+淋巴细胞水平 分别于感染前、感染后5、7、14 d无菌解剖小鼠取脾，常规分离脾细胞，配制成1×107浓度的脾细胞悬液;向100 μL体系中加入事先配制好的孵育刺激物和阻断剂的混合物 10 μL(PMA、Ionomycin、Monensin)，在 37℃，5%CO2温箱中孵育5 h;向实验管中加入CD3e-PerCP、CD8a-PE、CD4-PE 进行表面染色，反应30 min;实验管加入破膜剂1 mL，4℃，避光孵育 60 min，洗涤2 遍;加入10 μL IFN-γ-FITC 抗体进行胞内染色，4℃，避光，至少30 min，流式细胞仪进行测定。检测数据用CELLQUEST软件(Bec-ton Dickinson公司)。

2 结果与分析

2.1 Real-Time RT-PCR法测定病毒量

感染5 d后，肺病毒量同型组最低，为103.66，异型组为 106.69，异型加强组为 106.02，明显低于PBS组107.70(P﹤0.05)。说明异型免疫可以产生交叉保护免疫，降低感染后肺病毒量(图1)。

2.2 MTT法测定T淋巴细胞增殖活性

MTT法测定T淋巴细胞增殖活性见表1。异型组和异型加强组在病毒感染后5 d T淋巴细胞增殖活性明显高于感染前，且病毒感染后7d继续升高;与同型组和用PBS代替疫苗对照组差别显著(P ﹤0.05)。

图1 肺病毒量(10n)Fig.1 The virus load of lung(10n)

表1 T淋巴细胞增殖活性(A值)Table 1 The proliferous ability of T lymphocytes(A)

2.3 IFN-γ 阳性 CD3+CD8+/CD4+淋巴细胞水平

图2 IFN-γ阳性CD3+CD4+淋巴细胞水平Fig.2 The level of IFN-γ-secretion CD3+CD4+T lymphocyte

病毒感染后5 d，异型组和异型加强组IFN-γ阳性CD3+CD4+淋巴细胞水平明显高于感染前(P﹤0.05)，感染后7 d出现高峰，在感染后14 d回落，并与同型组差别显著;IFN-γ阳性 CD3+CD 8+淋巴细胞水平变化与IFN-γ阳性CD3+CD4+淋巴细胞水平相似，另外，异型加强组与异型组差别显著 (P﹤0.05)，IL-2加强该变化。说明感染后异型感染组Th1类CD4淋巴细胞和IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞水平升高，并有时间限制性;IL-2可以加强异型流感病毒感染后IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞水平。

图3 IFN-γ阳性CD3+CD8+淋巴细胞水平Fig.3 The level of IFN-γ-secretion CD 3+CD8+T lymphocyte

3 讨论

流感病毒变异快、流行广，成为现阶段最主要的公共卫生威胁之一。目前比较有效的干预措施就是疫苗接种，而现有的疫苗都是株特异性的，主要介导产生体液免疫，应用中存在保护效果差和对变异株无效等诸多缺陷，进而促使新型、高效的通用型流感疫苗的研制。自从1981年Lamb RA等［5］发现甲型流感病毒的基质蛋白M2以来，以M2蛋白作为抗原研究通用流感疫苗的重要性日益受到重视。Jegerlehner A等［6］用 M2e-HBc免疫小鼠，发现诱导的抗M2e抗体具有保护作用，但抗体不能直接有效地与病毒结合和中和病毒，而是通过抗体依赖细胞介导的细胞杀伤作用(Ab-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)发挥作用。很早就发现流感病毒核蛋白NP亦为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)反应的主要靶抗原，能够诱导机体产生细胞免疫，产生亚型间的交叉免疫保护作用［7］。对其流感病毒编码的各种蛋白质中存在的CD4+和CD8+T细胞表位亦有研究报道［8-10］。因此，研究细胞免疫在抗流感病毒感染中的作用及作用机制成为研发新型流感疫苗的基础。

T细胞作为免疫效应细胞主要行使两方面功能［11］，首先作为抗原特异的T细胞，直接发挥效应功能，例如CTL溶解特异性靶细胞;同时，T细胞又是免疫调节细胞［12］，具有辅助其他免疫细胞分化和调节免疫应答的功能，在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用。CD4+T淋巴细胞识别MHCⅡ类分子所提呈外源性抗原肽，活化后主要可以分为Th1和Th2，其中Th1主要分泌 IL-2、IFN-γ、TNF-β，主要介导细胞毒性作用和炎症有关的免疫应答，在机体细胞免疫中发挥重要作用。杀伤性T细胞(CTL)，受MHCⅠ类分子的严格限制，具有特异性、程序性和快速性的特点，通过识别启动、增殖分化及效应阶段对靶细胞进行杀伤。本研究显示，免疫后流感病毒感染，使T淋巴细胞的增殖活性明显增高，高于未免疫感染组。说明再次感染流感病毒时导致淋巴细胞增殖，引起T细胞免疫。另外，异型流感病毒感染后Th1类CD4+淋巴细胞和 IFN-γ+CD3+CD8+淋巴细胞明显增多，在感染后7 d急剧增加，而在感染后14 d又急剧回落到感染前的静息状态，与同型组比较差异显著。Zhang W等［13］认为抗原肽刺激后表达IFN-γ的CD3+CD8+淋巴细胞就可以视为抗原肽特异性CTL。而Wang KS等［14］则认为IFN-γ的产生有利于抗病毒感染保护性免疫。

IL-2是活化的T细胞产生的Th1细胞因子，此外CD8+T细胞和NK细胞也可产生［15］。虽然没有直接的抗病毒活性，但IL-2具有免疫调节活性，对于免疫反应是必需的，是机体免疫应答的核心因子之一。本研究进行了应用IL-2后抗异型流感病毒感染组的研究，结果表明，应用IL-2的异型流感病毒感染组IFN-γ阳性细胞占 CD3+CD8+淋巴细胞的数量比单纯异型流感病毒组及只使用IL-2组有显著性差异。表明，IL-2在抗异型流感病毒感染时，促进CTL的增殖和分化，或者说 IL-2诱导 CTL 产生 IFN-γ。Sun K 等［16］认为，Ⅱ型干扰素是流感病毒感染后巨噬细胞功能的调节因子，包括下调清道夫受体MARCO(胶原样巨噬细胞受体)以及促使巨噬细胞介导的病原体的吞噬和清除作用。这些都为新型疫苗的研发提供新思路。

本研究表明，异型流感病毒感染后激发T淋巴细胞的增殖活性，其CTL及Th1淋巴细胞增殖活性高于同型流感病毒，并有时间限制性。IL-2则可以加强异型流感病毒感染后CTL的增殖活性。本研究为探讨机体抗异型流感病毒感染机制及制备通用的、高效的抗流感疫苗提供了新思路。

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