HA/PDM自组装复合胶体粒子及其乳化性能

王娟勤 白绘宇 易成林 刘 娜 刘晓亚

(江南大学化学与材料工程学院,食品胶体与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122）

1 引言

带相反电荷的聚电解质可在水溶液中通过静电等相互作用自组装形成不同形貌的功能性复合物,因而备受学术界青睐.1-7天然大分子因其独特的生物相容性和亲水性,可获得更具潜在应用价值的聚电解质复合物.8-11Boddohi等12制备的一系列不同电荷比(n+/n-）的壳聚糖-肝磷脂(chi-hep）复合纳米粒子(PCN）及壳聚糖-透明质酸(chi-ha）PCN可使基材具有不同表面形貌,为修饰生物材料表面提供了一种有效手段.Jiang课题组13-16分别以阳离子壳聚糖-阴离子丙烯酸(CS-AA）,阴离子海藻酸-阳离子甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(ALG-DEA）为聚合物-单体复合体系,通过单体的原位聚合得到了一系列由静电作用诱导的尺寸可控、具有负载功能的CS-PAA空心纳米粒子及ALG-PDEA纳米粒子,提供了一种集原位聚合和静电复合于一体制备天然大分子自组装胶体粒子的新途径.

透明质酸(HA,p Ka=2.9±0.1）是一种直链线型阴离子粘多糖(示意图1(a））,具有优异的生物相容性及粘弹性,良好的水溶性和独特的保湿性.17-20作为聚阴离子电解质,HA能与阳离子物质通过静电作用组装成复合物.Lenormand等21的研究表明,在pH=4条件下103-106Da分子量范围内的HA都能与牛血清蛋白(BSA）通过静电作用获得HA-BSA复合物,其结构受HA分子链长度的影响.Xu等22,23研究了HA与光敏性1-甲基-4-(对甲酰苯乙烯基）吡啶甲基硫酸盐(SbQ）在水溶液中的自组装行为,获得了具有光响应性和疏水性药物负载功能的HA/SbQ复合胶束.

多糖和蛋白质等天然大分子常作为“天然”乳化剂和稳定剂制备水包油(O/W）乳液,以替代传统乳化剂应用于食品和化妆品等领域.24-26透明质酸因具有独特的保湿性目前已广泛用于高级化妆品,但其表面活性较差,无法单独作为乳化剂稳定乳液.Tømmeraas等27用烷烯基和芳香基琥珀酸酐(ASA）对HA接枝改性得到HA的衍生物ASA-HA,ASA的引入降低了HA的表面张力,从而改善了其乳化性.若能通过非共价作用提升HA乳化性,并拓展其应用会更有意义.

本文尝试以荷负电的HA与水溶性阳离子单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DM,p Ka=8.3）28组成聚合物/单体复合体系,并通过DM原位聚合形成由静电作用诱导的透明质酸/聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(HA/PDM）自组装复合胶体粒子(见示意图1）.考察了反应时间和pH值对复合胶体粒子性质的影响,并对所得胶体粒子的乳化性能及其影响因素进行初步探索,以期解决纯HA乳化性能较差的问题,拓展透明质酸在乳化方面的研究.

示意图1 (a）HA/PDM复合胶体粒子的形成过程;(b）不同pH条件下HA/PDM复合胶体粒子在油/水界面的吸附行为Scheme 1 (a）Schematic illustration of the formation of HA/PDM complex colloid particles;(b）oil-in-water interfacial behavior of the HA/PDM complex colloid particles with different pH values

2 实验部分

2.1 主要试剂

透明质酸钠:食品级,分子量为2.1×105Da,镇江东元生物科技有限公司;甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DM）:99%(w）,上海晶纯试剂有限公司,经碱性氧化铝过柱后使用;过硫酸钾(KPS）、盐酸、氢氧化钠:分析纯,中国医药集团上海试剂公司;白油:工业级,无锡市永真工业油品有限公司;透析袋:上海绿岛科技发展有限公司.

2.2 主要仪器

傅里叶变换红外(FTIR）光谱仪(2000-104型,加拿大FTLA公司）;ALV-5022型激光光散射(DLS,德国ALV公司,激光波长为632.8 nm,散射角为90°,温度为(25.0±0.1）°C）;Nano-ZS90型纳米粒度仪(英国Malvern公司）;Malvern Zetasizer2000型zeta电位仪(英国Malvern公司）;JEOL JEM-2100型透射电镜(TEM,日本JEOL电子株式会社）;pH计(PHS-3C型,上海天达仪器有限公司）;冷冻干燥机(FD-1A-50型,北京博医康实验仪器公司）;XHF-D型高速分散器(宁波新芝生物科技有限公司）;DMBA450型光学显微镜(厦门麦克奥迪实业有限公司）.

2.3 除盐透明质酸的制备

称取2.5 g透明质酸钠溶于100 mL去离子水中,搅拌下缓慢滴加1 mol·L-1盐酸水溶液至pH为2.0左右,继续搅拌1-2 h后将该溶液装入透析袋(截留分子量8-14 kDa）,在去离子水中透析3天除去钠离子和盐酸,冷冻干燥得到除盐透明质酸(HA）样品.

2.4 HA/PDM复合胶体粒子的制备

HA(0.5 g）和DM(0.294 g）溶于50 mL去离子水中,室温搅拌2 h使其完全溶解,得到HA/DM混合溶液.加入1.5 g KPS水溶液(2.5%,w）,氮气氛围下升温至60°C,KPS引发DM聚合反应,控制反应时间分别为15、30、60、90、120、180 min.最后将不同反应时间的反应液装入透析袋(截留分子量3.5 kDa）,在pH=5.0的缓冲液中透析24 h以除去未反应单体,得到不同反应时间的HA/PDM复合胶体粒子溶液,定容至10 g·L-1,调节pH=5.0.同样条件做空白实验,不加KPS,仅以HA/DM混合溶液加热反应.

2.5 HA/PDM复合胶体粒子的表征

2.5.1 HA/PDM复合物的FTIR表征

取少量HA/PDM复合溶液滴于载玻片上,置于40°C烘箱烘干成透明薄膜,将此薄膜用FTIR表征,分析HA/PDM复合物的特征吸收峰.

2.5.2 HA/PDM复合胶体粒子的粒径及zeta电位表征

用DLS分别测定不同反应时间和pH值时HA/PDM复合胶体粒子溶液的光散射强度、粒径及其分布.样品测试浓度为1.0 g·L-1,经直径为0.8 μm的微孔过滤膜除尘.

用zeta电位仪分别测定不同反应时间和pH值时HA/PDM复合胶体粒子的zeta电位.样品测试浓度为1.0 g·L-1,经直径为0.8 μm的微孔过滤膜除尘.

2.5.3 HA/PDM复合胶体粒子的形貌表征

将铜网放在覆有滤纸的表面皿中,取一滴(约7 μL）HA/PDM复合胶体粒子溶液(0.1 g·L-1,pH=5.0）滴于铜网上,室温干燥后用TEM观察胶体粒子形貌.

2.6 乳液的制备与表征

以2.4节所得10 g·L-1的HA/PDM复合胶体粒子溶液作为水相,白油为油相,体积比为1/1,用XHF-D型高速分散器以8000 r·min-1的转速下均质2 min.

通过电导率法和稀释法确定乳液类型.用数码相机拍摄乳状液放置一定时间后的表观状态.取乳状液用去离子水稀释,用DMBA450型光学显微镜观测乳液滴形态、大小及分布.

3 结果和讨论

3.1 HA/PDM复合物的FTIR表征

FTIR是研究聚电解质复合体系中两种物质间相互作用的常用表征手段.16,29纯HA、纯PDM和HA/PDM复合物的FTIR谱图如图1所示.HA的谱图中1732 cm-1归属于羧基的ν(C＝O）吸收峰,而HA/PDM谱图中此吸收峰强度减弱且右移至1717 cm-1,同时在1610 cm-1出现了新的吸收峰,为HA的ν(COO-）反对称吸收峰,这是由于HA中羧基与PDM中质子化的叔胺形成了离子键所致,而在HA和PDM谱图中,此吸收峰并不明显,说明HA和PDM间存在静电相互作用.

3.2 HA与PDM在水溶液中的自组装行为

用DLS追踪了2.4节所述过程,不同反应时间下HA与PDM复合体系在水溶液中的自组装行为,结果如图2所示.

图1 HA、PDM和HA/PDM复合物的FTIR谱图Fig.1 FTIR spectra of HA,PDM,and HA/PDM complex

从图2可知,随反应时间延长,HA/DM溶液的光散射强度较小且基本不变,说明溶液中无引发剂KPS时,DM未聚合,以单体形式分散在水溶液中,HA则以无规聚集体形式存在于水溶液中,两者并未形成复合物聚集体,光散射强度较小;而加入KPS后,DM的逐步聚合使得HA/PDM复合溶液光散射强度随反应时间增加而逐渐增大,说明HA/DM复合体系经KPS引发后DM原位聚合形成PDM,PDM和HA间存在较强的静电相互作用,诱导HA/PDM自组装形成复合胶体粒子,因而光散射强度增大,该形成过程如示意图1(a）所示.

3.3 HA/PDM复合胶体粒子的粒径和zeta电位

用DLS和zeta电位仪研究了反应时间对HA/PDM复合胶体粒子粒径及zeta电位的影响,结果如图3所示.

图2 反应时间(t）对HA/DM及HA/PDM复合溶液光散射强度的影响Fig.2 Influence of polymerization time(t）on the scattering intensities of the HA/DM and HA/PDM complex solution

图3 HA、PDM和HA/PDM复合胶体粒子粒径(D h）及zeta电位随反应时间的变化曲线Fig.3 Average hydrodynamic diameters(D h）and zeta potential of HA,PDM,and HA/PDM complex colloid particles as a function of polymerization time

图3(b）为不同反应时间(t）下HA/PDM复合胶体粒子的粒径变化.t=0 min时,溶液中无HA/DM复合胶体粒子存在.t=15 min时,DM逐渐聚合形成PDM,PDM与HA之间因静电作用形成较松散复合胶体粒子,此时复合溶液的光散射强度为32.2(图2）,胶体粒子粒径(Dh）为(291.4±0.75）nm.随聚合反应的进行,胶体粒子粒径逐渐变小,说明HA和PDM的静电作用加强,HA链与PDM链段缠绕更加紧密,使粒子收缩,因而粒径减小并趋于稳定.Jiang等15研究了CS-PAA纳米粒子也得到类似结果.而作为空白对照的HA和PDM溶液,光散射强度全程基本无变化,DLS无法测得粒径,说明单纯的HA体系和PDM体系延长反应时间始终无聚集现象发生.HA溶液的zeta电位均为负值,PDM溶液的zeta电位均为正值,而HA/PDM复合胶体粒子溶液的zeta电位介于两者之间,说明HA和PDM链段间确实存在静电相互作用,诱导复合胶体粒子生成,离子化HA-COO-链在粒子表面富集,使得粒子表面荷负电,起到稳定粒子作用.

3.4 HA/PDM复合胶体粒子的形貌

为直观地观察HA/PDM复合胶体粒子形成前后体系状态,对HA/DM混合体系和HA/PDM复合物进行TEM拍摄,如图4所示.当DM聚合反应开始前(图4(a））,未观察到规则胶体粒子,溶液中无HA/DM复合物聚集体存在.DM聚合后(图4(b）,t=180 min）,HA/PDM复合胶体粒子则呈球形,粒径分布较宽.

TEM观察到的胶体粒子平均粒径略小于DLS测试结果((238.80±1.04）nm）,这是因为DLS是在溶液状态测试,粒子因亲水性较强而充分溶胀;TEM则在干态下测试,粒子在干态下产生塌陷收缩,导致粒径变小.30

图4 HA/DM(a）和聚合180 min得到的HA/PDM复合胶体粒子(b）的TEM图像Fig.4 TEM images of HA/DM(a）and HA/PDM complex colloid particles obtained after 180 min polymerization(b）

3.5 HA/PDM复合胶体粒子的pH敏感性

HA和PDM均具有pH敏感性,因此pH值会对胶体粒子的zeta电位和粒径产生影响.HA/PDM复合胶体粒子的zeta电位随pH值变化曲线如图5a所示,发现随pH值增大,zeta电位值逐渐减小,并出现了由正到负的转变.这是由于pH较低时(pH＜2.85）,羧酸基团电离受到抑制,而－NH－和－N(CH3）2基团质子化程度较大,使得HA/PDM复合物的净电荷为正,zeta电位值为正.当pH值为2.85时,胶体粒子的zeta电位值为零,其对应的pH值为等电点.随pH值升高,羧酸根电离程度增大,zeta电位值递减.对比纯HA电位变化曲线(图5b）发现,HA/PDM复合胶体粒子的电位值均大于HA,这是由于PDM与HA存在相互作用,中和了部分羧酸根所致.

HA/PDM复合胶体粒子的粒径随pH值变化曲线如图5c所示,由于HA和PDM链离子化程度受pH影响,胶体粒子粒径受pH影响也较大.当pH=1.49时,PDM质子化程度很高,而HA羧酸根电离程度很低,体系荷正电,静电与氢键协同作用使得胶体粒子结构较稳定,粒径较小.当pH=2.50-3.00时,接近胶体粒子等电点,粒子间因静电斥力消失而絮凝,26因此粒径急剧增大(区域I）.pH=3.50-4.00时,絮凝消失,胶体粒子重新形成且粒径较小;进一步提高pH值,PDM质子化程度减小,诱导胶体粒子收缩,而HA离子化程度增加,亲水性增强促使胶体粒子溶胀,在两者共同作用下胶体粒子的粒径缓慢增大.当pH＞8.07时,HA离子化程度进一步增强使得分子链充分溶胀伸展,而PDM的质子化受到抑制,故两者无法通过静电作用形成复合物(区域II）.对于纯HA溶液,由于不同pH值下均为无色透明,不能形成胶体粒子,光散射强度很低,因此DLS无法测得粒径.

图5 HA/PDM复合胶体粒子和HA的粒径及zeta电位随pH值变化曲线Fig.5 Average hydrodynamic diameters and zeta potential of HA/PDM complex colloid particles and HA versus pH values

3.6 HA/PDM复合胶体粒子的乳化性能

以2.4节所得HA/PDM复合胶体粒子水溶液为水相,白油为油相,体积比为1/1,经2.6节的方法进行充分乳化制备乳液,经电导率法和稀释法确定所得乳液为O/W型.由于HA/PDM复合胶体粒子具有pH敏感性,其表面性质会受pH影响,从而影响其乳化性能,因此本文初步考察了pH对HA/PDM复合胶体粒子溶液乳化性能的影响,以纯HA溶液和纯PDM溶液进行空白对照实验.

对纯HA体系而言,pH值对其稳定的O/W乳液滴粒径的影响如图6(a）所示,当pH=2.50时,乳状液最稳定,乳液滴粒径较小且分布较均一,原因是此pH值接近HA等电点,羧酸根电离度较小使HA荷电量较低,亲水性减弱,在油水界面吸附能力增强;同时HA分子内及分子间氢键作用增强,形成了氢键网络结构,粘度急剧增大,具有类似溶胶-凝胶行为,17,31降低了油滴的运动速度从而阻止油滴聚并,得到稳定乳液.32,33提高HA溶液pH,乳液滴粒径迅速增大,乳化性能较弱,说明pH增加使HA羧酸根电离程度增大,荷电量升高,静电排斥力增大;同时HA亲水性增强,易于从油水界面脱离进入水相,造成宏观破乳.

图6 不同pH值时HA、PDM和HA/PDM复合胶体粒子水溶液乳化白油的O/W乳液静置48 h后的光学显微镜照片及表观数码照片Fig.6 Optical micrographs and digital photographs of O/W emulsions(48 h after emulsification）stabilized by HA,PDM,and HA/PDM complex colloid particles aqueous solution with various pH values

pH值对PDM溶液稳定的O/W乳液滴粒径的影响如图6(b）所示,当pH=1.50时,由于叔胺充分质子化,PDM亲水性较强,表面活性较差,基本无乳化性,乳液滴粒径较大.在pH值为5.10-7.50之间时,乳化性能则有较大提高,乳液滴粒径减小,原因是叔胺质子化程度减小,PDM呈弱疏水性以传统大分子链形式吸附于油水界面.34进一步提高溶液pH值到9.00时,乳液滴粒径明显增大且分布不均一,乳液层高较低,乳化性能减弱,可能由于过碱条件下PDM质子化受到抑制,链段疏水性增强不易在界面上稳定吸附,乳液滴易聚并.

pH值对HA/PDM复合胶体粒子溶液稳定的O/W乳液滴粒径的影响如图6(c）所示.当pH=1.49时,乳液滴粒径较小,乳液稳定,原因是羧酸基团电离作用受到抑制,HA/PDM复合胶体粒子粒径较小(图5c）,亲水性减弱,能稳定吸附于油水界面,乳化效果较好,见示意图1(b）.当pH=5.14时,羧酸基团电离度增大,胶体粒子亲水性增强,乳液滴粒径变大,但乳液稳定性仍较纯HA体系好.当pH=7.54时,胶体粒子因HA电离度增大而溶胀,乳液稳定性较HA有较大提高,可能原因是胶体粒子溶胀与外围大分子链共同作用在油水界面形成协同效应,使得乳液较稳定,见示意图1(b）.pH=9.03时,HA链段间静电排斥力增强而充分溶胀,胶体粒子结构松散甚至部分解离,但乳化效果却进一步提高,乳液滴粒径较小且分布均一,乳液层高度较高,明显优于纯HA和PDM体系的乳化性能,可能主要是以PDM/HA大分子链表面活性剂的形式起乳化作用,35故乳液稳定,见示意图1(b）.

4 结论

以阴离子HA与阳离子DM组成聚合物/单体复合体系,在水溶液中成功地通过DM原位聚合制备了PDM,由HA羧酸根离子和PDM叔胺离子之间静电作用诱导自组装得到球形HA/PDM复合胶体粒子.在0-180 min反应时间内,胶体粒子的zeta电位均为负值,其粒径随反应时间延长逐渐减小并趋于稳定.pH值对胶体粒子的表面性质有较大影响,通过改变pH值可得到不同荷电量和粒径的胶体粒子,但较碱性条件下(pH＞8.07）HA和PDM间的静电作用较弱而无法形成复合物聚集体.此外,HA/PDM复合胶体粒子乳化性能受pH值影响也较大,较酸性(pH=1.49）和较碱性(pH=9.03）条件下乳液稳定性较佳,同时HA/PDM复合体系的乳化性能较纯HA和PDM均有较大提高,实现了以非共价作用提升HA乳化性能的新途径.

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