原癌基因蛋白18第38位丝氨酸点突变肝癌细胞系的建立

李 娟，龚 舒，刘陆阳，陶忠桦，王 琼，甘 淋

原癌基因蛋白18(oncoprotein 18，Op18)是一种广泛分布的胞浆磷酸化蛋白，参与微管的解离和聚集，其 N末端包括丝氨酸(serine，Ser)16、Ser25、Ser38和Ser63磷酸化位点，分别由不同的蛋白激酶进行调控发挥不同作用[1-3]。研究发现，Op18的不同位点的磷酸化在细胞生长增殖、凋亡、运动和形态改变的过程中发挥作用[4-5]。本研究小组前期实验采用免疫组化、Western blot等方法检测肝癌组织中Op18不同位点磷酸化状态的差异，发现较未转移肝癌Op18第38位丝氨酸磷酸化(pS38)在转移性肝癌中表达增高，提示Op18 Ser38位点磷酸化状态可能参与肝癌的侵袭转移。

本文利用重叠延伸聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，定点诱变技术，拟构建Op18 Ser38磷酸化位点突变(S38A)的重组质粒，并转染肝癌细胞株HCCLM6筛选建立稳定表达Op18野生型(wild sypes，wt)和Op18 S38A的肝癌细胞模型，为进一步研究Op18位点磷酸化在肝癌发病中的分子机制提供细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料 Flag-pcDNA3.1-Op18 wt质粒由Texas大学Baldassarre教授馈赠;肝癌细胞株HCCLM6和JM109菌株由泸州医学院医学基础研究中心保存。限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、KOD plus购自美国NEC公司;引物由上海生工生物工程公司合成;胶回收和质粒抽提试剂盒购自日本TaKaRa Biotech公司;Flag、Op18和Op18 Ser38磷酸化抗体购自美国Santa Cruz公司;一般试剂为进口和国产分析纯级产品。

1.2 方法

1.2.1 Op18真核表达载体的定点突变

1.2.1.1 选择定点突变位点 选择Flag-pcDNA 3.1-Op18 wt的第38位丝氨酸位点，使其定点突变为丙氨酸，设计并合成引物如下:Op18-F:5'-AGAATTCCCCCTTGCTCCTCCAAAGAAGA-3';Op18-R:5'-TCTTCTTTGGAGGAGCAAGGGGGAATTCT-3';Op18-SF:5'-CCCAAGCTTATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGGCTTCTTCTGAT-3';Op18-SR:5'-CGCGGATCCTCAGTCTCGTCAGCA-3'。

1.2.1.2 测定模板DNA行PCR 具体方法参见文献[6]，即测定 Flag-pcDNA3.1-Op18 wt的浓度，采用50 μl体系行PCR。Op18 S38A前段扩增条件:95℃预变性 5 min，95℃ 30 s，60.25℃ 30 s，72℃ 24 s，扩增30个循环。Op18 S38A后段PCR扩增:95℃预变性 5 min，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 25 s，扩增30个循环。

1.2.1.3 Op18位点突变 Op18位点突变PCR产物行胶回收，测定浓度后行 PCR。KOD Plus 1 μl，10×PCR buffer 5 μl，dNTP Mix 5 μl，Op18-SF 和Op18-RF引物各1.5 μl，模板Op18 S38A前段1.25 μl和后段 1 μl，MgSO42 μl，最后加入双蒸水补足体积。PCR 扩增:95℃ 预变性 5 min，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 35 s，扩增 30 个循环，72℃延伸 7 min。

1.2.1.4 双酶切产物连接 BamHⅠ和HindⅢ双酶切PCR产物，酶切体系PCR产物1 μg，BamHⅠ和 HindⅢ各 1 μl，10×蛋白酶 K buffer 1 μl，用双蒸水补足体积至20 μl，37℃ 1 h;胶回收后用 T4DNA连接酶16℃连接过夜。

1.2.1.5 转化并鉴定 转化大肠杆菌JM109感受态，37℃培养过夜。挑取单克隆，抽提重组质粒;用BamHⅠ和HindⅢ行双酶切鉴定，并将突变质粒送上海英骏生物公司测序。

1.2.2 稳定转染的细胞克隆的筛选及建立

1.2.2.1 抗生素浓度筛选 抗生素hygromycin对肝癌细胞株HCCLM6的毒性实验发现致死浓度为400 μg/ml。

1.2.2.2 抗生素筛选 按照LipofetamineTM2000说明书，将Op18 wt和Op18 S38A质粒转染肝癌细胞株HCCLM6，48 h后加入hygromycin进行压力筛选。

1.2.2.3 稳定细胞株建立 挑取初筛克隆消化计数，极限稀释后移至96孔细胞培养板(终质量浓度为1个细胞/孔)。37℃、5%CO2孵箱中培养直至克隆形成。选取生长良好的单克隆进行传代培养，并用Western blot印迹鉴定，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参。

2 结果

2.1 Op18 S38A点突变重组质粒的构建与鉴定选用重叠延伸PCR方法行定点突变，将Op18第38位的丝氨酸定点突变为丙氨酸，构建Op18 S38A重组质粒。将重组质粒转化JM109细菌后筛选，抽提Op18 S38A重组质粒分别进行酶切和测序鉴定。采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切重组质粒得到5 480 bp的 Flag-pcDNA3.1载体片段和480 bp的插入片段。测序报告显示，重组质粒中的插入片段序列包含预期突变位点(Op18 S38A)以及Flag标签，其他的氨基酸位点未发生突变。

2.2 稳定表达Op18 wt和Op18 S38A质粒的肝癌细胞株HCCLM6的建立和鉴定 采用脂质体转染，极限稀释和单克隆法筛选稳定表达Flag-pcDNA3.1空载体、Op18 wt和Op18 S38A的肝癌细胞株HCCLM6，分别标记为control、Op18 wt和Op18 S38A细胞。分别提取3种细胞的总蛋白，进行蛋白定量后用Western blot检测Flag、Op18及其pS38磷酸化水平的表达。实验结果显示，control、Op18 wt和Op18 S38A细胞株中Flag的蛋白相对表达量分别为0.48±0.09、0.52±0.09、和 0.53±0.10，提示 3 个细胞株的转染效率差异无统计学意义(P＞0.05)。进一步检测Op18及其pS38水平发现:control、Op18 wt和Op18 S38A细胞株中 Op18蛋白相对表达量为0.16±0.05、0.76±0.12、和 0.41±0.02，提示 Op18 wt和Op18 S38A中Op18表达明显上调(P＜0.01);而其pS38蛋白相对表达量为0.32±0.017、0.78±0.02和0.36±0.04。与Op18 wt比较，在Op18 S38A细胞株中Op18 pS38表达量降低(P＜0.05)，突变株中该突变位点的磷酸化水平均下降，显示稳定细胞株已成功建立(图1)。

图 1 Flag、Op18 和 Op18 pS38 在 control、Op18 wt和Op18 S38A细胞株中的蛋白表达

3 讨论

磷酸化修饰是翻译后修饰中最重要的修饰方式之一，几乎所有的生命活动过程都涉及到蛋白质的磷酸化修饰。大量研究发现，肿瘤的进程与蛋白质的磷酸化异常紧密相关，提示蛋白质磷酸化状态的改变可能在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用[7-10]。而目前位点磷酸化的功能研究主要采用功能缺失研究，如进行片段缺失或者磷酸化位点点突变方法等。

体外定点突变技术是研究基因和蛋白质结构功能的重要技术之一。为深入探讨基因的功能，需要对基因进行点突变(包括碱基替代、缺失或插入等)以观察基因功能的改变。以多重PCR为基础的定点突变技术(site-directed mutagenesis)[11-13]是近年发展的分子生物学技术，具有迅速、经济、方便等优点，并可在DNA片段的任意位置定点突变，广泛应用于基因、蛋白质的结构和功能的基础研究。

为探讨Op18 pS38状态与肝癌发生、发展的关系，构建一个Op18 wt和Op18 S38A的肝癌细胞株非常必要。本实验先采用基因定点突变的技术，在Flag-pcDNA3.1-Op18 wt重组质粒上定点突变其38位的丝氨酸变为丙氨酸，构建Op18 S38A重组质粒，经测序鉴定突变正确。本实验选用了最经济实用的多重PCR法进行了Op18的特定位点的点突变。此法的关键是以待突变的碱基为中心设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，后去掉模板将突变的两段产物进行连接，最后进行PCR扩增突变的序列。本方法虽然进行多次PCR、DNA纯化、回收，实验步骤稍显繁杂，但是本方法价格低廉，引物设计简单，成功率高，结果令人满意。将突变成功的重组质粒用Lipo2000脂质体转染入肝癌细胞株HCCLM6，采用单克隆筛选法，在抗生素压力筛选下建立稳定表达FLAG-pcDNA3.1空载体、Op18 wt和Op18 S38A的细胞株，并进一步通过Western blot方法进行鉴定，证实建株成功。这为进一步解析Op18 pS38状态的改变对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭运动等生物学功能的影响，为探讨Op18 pS38状态参与肝癌发生、发展的分子机制提供了优良的细胞模型。

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