透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响

李萍 向彬 曾常茜

透骨草(Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara)为透骨草科植物的干燥全草入药，产于凌源、绥中、金洲、大连等地，其化学成分为透骨草素、倍半木酚素、呋喃类等，主治黄水苍、湿疹、跌打损伤、骨折等，具有清热解表、活血消肿作用［1-3］。本文在其传统功效的基础上，观察透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响，并通过检测透骨草提取物对SMMC-7721细胞β-catenin和cyclin D1蛋白表达的影响，进一步探讨透骨草提取物对SMMC-7721细胞作用的分子机制，旨在为透骨草抗肝癌作用的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器 人肝癌SMMC-7721细胞，由吉林省肿瘤研究所提供;鼠抗人β-catenin、鼠抗人cyclin D1抗体购自均购自北京中杉金桥公司，通用型SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。RPMI 1640、小牛血清和胰蛋白酶为美国Gibco公司产品;MTT和DMSO为Sigma公司产品;药物采自辽宁金州大黑山，经王心毓老先生鉴定为透骨草科植物(Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara);酶联免疫检测仪(Sunrise F039300)，奥地利 Tecan公司;BB16UV型 CO2培养箱，德国Heraeus公司。

1.2 方法

1.2.1 透骨草提取物制备方法:取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2 h，过滤，滤液水浴浓缩成干膏。

1.2.2 细胞培养:使用RPMI 1640培养基，应用时加入青霉素100 U/ml、链霉素100 mg/L和含10%灭活的小牛血清。人肝癌SMMC-7721细胞置于37℃ 5%CO2培养箱中培养。

1.2.3 MTT法检测SMMC-7721细胞增殖:将SMMC-7721细胞常规培养于RPMI 1640培养液，5%CO237℃培养。取对数生长期细胞，用RPMI 1640培养液制成1×107/L单细胞悬液，接种96孔培养板，每孔200μl，5%CO237℃培养24 h。弃去培养液，分别加入终浓度为 6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml的透骨草提取物，每孔200μl，培养 72 h。每孔加入20μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h。弃去培养液，每孔加入 100μl DMSO，振荡15 min。用酶联免疫检测仪以波长570 nm测定各孔吸光度值(A)。根据如下公式计算抑制率:抑制率(%)=(1-给药孔平均A值/对照孔平均A值)×100%。NOSA2.30软件Bliss法计算IC50，采用透骨草提取物浓度作横轴，抑制率作纵轴绘制曲线图。

1.2.4 免疫组化方法检测SMMC-7721细胞β-catenin和cyclin D1蛋白的表达:按试剂盒说明进行操作。将对数生长期的细胞以1.0×105/ml细胞浓度加入培养瓶中，37℃ 5%CO2培养24 h，待细胞贴壁后，其中一瓶加入透骨草提取物，终浓度为40.91μg/ml(IC50)，另外一瓶加1640培养液，设为对照。继续培养96 h，弃去培养液，PBS洗2次，消化并收集细胞，用PBS将细胞稀释成1.0×106/ml，涂片，丙酮固定20 s，PBS冲洗2 min×3次，滴加1滴内源性过氧化物酶阻断剂以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育15 min，PBS冲洗3 min;加1滴封闭用正常非免疫动物血清，室温孵育15 min，弃血清，分别加1滴鼠抗人 β-catenin抗体、cyclin D1抗体，37℃孵育2 h，PBS冲洗2 min×3次。加1滴生物素标记的第二抗体，室温孵育15 min，PBS冲洗2 min×3次，加1滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗2 min×3次，加DAB底物混合工作液，镜下观察显色，自来水冲洗终止显色，再用苏木素复染，封片，置于倒置显微镜下观察。β-catenin阳性染色定位于细胞膜，cyclinD1阳性染色定位于细胞核，随机计数200个细胞，计算阳性细胞占所有细胞的比例。

1.3 统计学分析应用SPSS11.5统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 透骨草提取物对SMMC-7721细胞增殖的影响 6.25～200μg/ml的透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞的吸光度(A570 nm)值与对照组相比显著降低(P＜0.05)，而且随着透骨草提取物浓度的增加，A570 nm值的降低更加明显。见表1、图1。

表1 MTT法检测SMMC-7721细胞增殖的结果

2.2 透骨草提取物对SMMC-7721细胞β-catenin和cyclin D1蛋白表达的影响 未用透骨草提取物处理的对照组SMMC-7721细胞β-catenin蛋白表达较高，细胞膜着黄色的细胞量多，经40.91μg/ml透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞βcatenin蛋白表达明显降低，细胞膜着黄色的细胞量少(P＜0.05);未用透骨草提取物处理的对照组SMMC-7721细胞cyclin D1蛋白表达较高，细胞膜着黄色的细胞量多，经40.91μg/ml透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞cyclin D1蛋白表达明显降低，细胞核着黄色的细胞量少(P＜0.05)。见表2。

图1 透骨草提取物对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

表2 免疫组化法检测SMMC-7721细胞β-catenin和cyclin D1蛋白表达结果%，±s

表2 免疫组化法检测SMMC-7721细胞β-catenin和cyclin D1蛋白表达结果%，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05

-catenin cyclin D1对照组组别 β 43.6±2.1 56.2±2.4透骨草提取物处理组 16.3±1.3* 19.3±1.5△

3 讨论

我们前期研究报道，透骨草提取物对人卵巢癌SK-OV-3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌胞Hela细、人肝癌HepG-2细胞、人肺癌A549细胞增殖有显著的抑制作用，且呈一定的剂量依赖性［4］。本实验采用MTT法首次发现，透骨草提取物对SMMC-7721细胞具有显著的增殖抑制作用，并且呈一定的剂量依赖性。

β-catenin是一种多功能细胞质内的可溶性蛋白，由于它在细胞黏附和增殖过程中的双重作用，已成为肿瘤发生发展机制研究中的热点［5］。近来研究表明，β-catenin在细胞质和核内的累积是恶性肿瘤中的常见事件之一，在肝细胞癌中β-catenin异常表达并与肝癌发生相关［6，7］。Cyclin D1作为原癌基因，参与细胞的增殖、分化与凋亡，并且与多种肿瘤发生发展有关［5］。近来研究显示，cyclinD1是Wnt信号转导通路非常重要的靶基因，在肝细胞癌中异常表达［8，9］。

本实验用免疫组化方法研究发现，40.91μg/ml透骨草提取物可使人肝癌SMMC-7721细胞β-catenin表达均下降，说明透骨草提取物可能通过下调SMMC-7721细胞β-catenin和cyclin D1蛋白的表达抑制SMMC-7721细胞增殖。本实验的研究结果突破了透骨草传统功效的范围，发现了其新的药用价值，扩大了应用范围。有关增殖抑制的调控机制有待进一步研究。

1 江苏新医学院主编.中药大辞典(上册).第1版.上海:上海科技出版社，1977.1878.

2 北京药品生物制品检定所，中国科学院植物研究所主编.中药鉴别手册，第1册.北京:科学技术出版社，1972.128.

3 高松主编.辽南地区药用植物图鉴.第1版.北京:科学出版社，2008.196.

4 曾常茜，高松，沈阳，等.透骨草提取物对肿瘤细胞体外增殖的影响.辽宁中医杂志，2009，36:1952-1954.

5 Jennifer LF，Darya P，Samuel JP.Wnt signaling in development and disease.Neurobiology of Disease，2010，38:148-153.

6 Li YP，Wu CC，Chen WT，et al.The expression and significance of WWOX and β-catenin in hepatocellular carcinoma.APMIS，2012，21:1273-1276.

7 Lachenmayer A，Alsinet C，Savic R，et al.Wnt-Pathway Activation in Two Molecular Classes of Hepatocellular Carcinoma and Experimental Modulation by Sorafenib.Clin Cancer Res，2012，18:4997-5007.

8 Che Y，Ye F，Xu R，et al.Co-expression of XIAP and cyclin D1 complex correlates with a poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.Am J Pathol，2012，180:1798-1807.

9 Jung KH，Kim JK，Noh JH，et al.Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression of cyclin D1 and CDK2 in human hepatocellular carcinoma.J Cell Biochem，2010，110:687-696.