幽门螺杆菌感染对胃黏膜组织TGF-βRI表达的影响

高文娟

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染是慢性胃炎的主要病因，已被世界卫生组织列为胃癌的Ⅰ类致癌危险因素［1］。胃癌的发生是一个多阶段渐进的过程，H.pylori在正常胃黏膜向癌前病变和胃癌转化过程中对细胞生长的影响如何尚不明确。转化生长因子 β(transforming growth factor beta，TGF-β)是重要的细胞生长调控成分，与肿瘤的发生关系密切。我们先前的研究已发现，在慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)组织和重度肠化生(intestinal metaplasia，IM)胃黏膜组织中，H.pylori感染与TGF-β1表达的上调有关，而胃黏膜中重度不典型增生(dysplasia，Dys)组织及胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GAC)组织中则没有发现这种相关性，提示H.pylori对TGF-β1的影响可能主要作用于胃癌发生的早期［2］。在此基础上，我们认为研究H.pylori相关性胃炎及伴有癌前病变的胃黏膜对了解H.pylori与TGF-β1的关系更为重要。TGF-β受体是介导TGF-β作用的关键结构，有关H.pylori感染与TGF-βRI表达水平的关系尚未受到重视。本文采用H.pylori快速尿素酶试验(HpRUT)、PCR-Hp-16SrRNA检测和14C-尿素呼气试验(14C-UBT)同步检测CSG、重度IM和中重度Dys组织中H.pylori感染情况，并以免疫组化方法分别检测其中TGF-βRI的表达，探讨H.pylori感染对TGF-βRI表达的影响及对胃癌发生过程的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2008年2月至2009年4月间胃镜活检标本，筛选108例进入研究。其中CSG49例(CSG组，H.pylori阴性的轻度CSG 16例;H.pylori相关性CSG 33例)，重度IM 39例(IM组)，中重度不典型增生20例(Dys组)(中度13例，重度7例)。所有标本在胃窦距幽门3 cm以内取2块胃黏膜组织，1块即行HpRUT，1块-7℃保存，备PCR检测。另各取病灶胃黏膜组织2块，100 ml/L中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。

1.2 方法

1.2.1 H.pylori检测

1.2.1.1 Hp-RUT:采用HpUT-H104试剂盒(分析化学法，福建三强生化有限公司)，5 min以内呈黄至棕黄色为阳性，不变色为阴性。

1.2.1.2 PCR-Hp-16SrRNA检测:采用PE9600PCR仪(Perkin-Elmer公司)，PCR-Hp-16SrRNA 引物序列 CP-1:5’-GCG CAA TCA GCG TCA GGT AAT G-3’，CP-2:5’-GCT AAG AGA TCA GCCTAT GTCC-3’，扩增片段500 bp，产物2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下呈与阳性对照相同位置的明显条带为阳性。

1.2.1.3 14C-UBT:患者在检查前4周内未服用抗H.pylori药物，以100 dpm/mmol CO2为诊断阈值，大于诊断阈值判为H.pylori阳性。

1.2.2 H.pylori诊断标准:Hp-RUT、PCR-Hp-DNA和14C-UBT 3项检测中2项以上阳性者判为H.pylori阳性;均阴性判为H.pylori阴性，仅1项阳性者未进入本研究。

1.2.3 免疫组化染色结果判断:按A:无染色为0分，细胞膜或浆内见淡黄色颗粒、明显高于背景为1分，较多棕黄色颗粒为2分，大量深棕黄色颗粒为3分;B:每片随机观察5个视野，计数500个细胞中染色阳性细胞数，阳性细胞数＜30%为1分，31%～75%2分，＞76%为3分。A×B得0者为-，1～4分为+，4分以上++。

1.2.4 TGF-βRI检测:采用免疫组化 SP 法，即用型 TGF-βRI抗体及SP试剂盒，PBS代替一抗为阴性对照，室温下操作:①切片脱蜡至水;②每步用PBS工作液洗3次，每次3 min;③过氧化酶阻断剂10 min;④10%非免疫血清孵育10 min;⑤第一抗体孵育60 min;⑥生物素标记的第二抗体孵育10 min;⑦链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶孵育10 min;⑧DAB显色;⑨苏木素复染、中性树胶封固。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计数资料采用χ2检验、spearman等级相关分析及Kolmogorov-Smirnov检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H.pylori感染情况 CSG组67.35%(33/49)H.pylori阳性，IM组为82.05%(32/39)，Dys组为60%(12/20)。其中中度Dys组为53.85%(7/13)，重度 Dys组为71.43%(5/7)。3组H.pylori阳性率无显著性差异(χ2=3.825，P=0.148)。见表1。

表1 3组H.pylori感染情况 例

2.2 TGF-βRⅠ表达与H.pylori感染 TGF-βRⅠ阳性反应产物呈深棕色，分布于胞膜及胞质。等级相关分析发现，从CSG、IM到中度、重度Dys组，各组中H.pylori阳性者TGF-βRI的表达与病变的严重程度呈负相关(r=-0.707，P＜0.01)，随黏膜病变程度的加重，TGF-βRI表达呈减少趋势;而各组中H.pylori阴性者无1例TGF-βRI表达缺失，Kolmogorov-Smirnov检验示4组H.pylori阴性者TGF-βRI表达无显著差异(Kolmogorov-Smirnov Z=1.162，P=0.134)。见表2、3。

表2 4组中H.pylori阳性者TGF-βRI表达情况 例

表3 4组中Hp阴性者TGF-βRI表达情况 例

3 讨论

目前公认H.pylori持续感染可引起慢性胃炎，进而引起胃黏膜细胞代谢改变，阻断胃液中抗坏血酸的主动分泌机制，当H.pylori感染慢性胃炎发展至萎缩和肠化时，胃酸分泌减少，胃内pH升高，不但降低了胃中和环境致癌原的能力，而且有利于细菌繁殖，并促进N-亚硝基化合物的形成，从而有利于胃癌的发生。在这一过程中，H.pylori对胃黏膜上皮细胞增殖调控的影响机制十分复杂。我们的研究曾经发现，H.pylori阳性的IM及Dys胃黏膜组织中，PCNA高表达者显著多于H.pylori阴性组，提示H.pylori感染确可增加胃黏膜细胞的增殖，同时发现在GAC组中PCNA的表达与H.pylori的感染情况无关，这可能提示H.pylori主要作用于胃癌发生的早期［3］。

TGF-β家族是一类多功能的细胞因子，哺乳动物表达其中的 TGF-β1，2，3。TGF-β 家族有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受体，其中Ⅲ型受体不直接传递信号，TGF-β的信号是通过Ⅰ、Ⅱ型受体与TGF-β配体形成复合物，活化Ⅰ型受体的STK激酶而传递到胞内。TGF-β及其受体的功能是影响细胞生长调控的重要因素，参与了胃癌的发生［4］。我们率先对H.pylori与TGF-β1表达进行的研究发现，H.pylori感染可上调胃黏膜TGF-β1的表达，但这一作用主要出现在癌前病变组织［2］。于TGF-β1的表达存在反馈调节机制，TGF-β1的高表达可能与组织获得产生TGF-β1的能力有关。作为致癌危险因子的H.pylori感染是否通过影响TGF-β受体在胃黏膜癌前病变的表达进而影响胃癌的发生，应是了解H.pylori在胃癌发生过程中作用的一个重要内容。本研究中我们发现，在H.pylori阳性的病例，从CSG、IM到中度、重度Dys组，随黏膜病变程度的加重，TGF-βRI表达呈减少趋势，病变程度与TGF-βRI表达之间呈负相关关系，H.pylori感染明显下调了TGF-βRI的表达，这种情况下，高水平的TGF-β1可能对自身无抑制效应，但可抑制周围组织的增殖和淋巴细胞的免疫作用，从而有利于肿瘤的生长。大量的TGF-β1一方面可减轻机体产生的炎性反应，另一方面可能通过抑制TH1型和增强TH2型的免疫应答调低免疫反应，导致H.pylori感染慢性化［5］。H.pylori持续感染不但可诱导有丝分裂，且慢性炎症过程中DNA链断裂和染色体损伤的积累，有利于内源性突变发生［6］。与此同时，我们发现各组中H.pylori阴性者无1例TGF-βRⅠ表达缺失，且其TGF-βRI表达无显著差异。因此我们认为，H.pylori感染可能是诱发胃黏膜癌前病变组织TGF-βRⅠ表达缺失，进而逃避TGF-β1诱导的细胞凋亡，丧失胃黏膜高增殖状态下DNA复制的精密性，从而向癌变演化过程的又一个重要影响因素。

1 朱亚杰，邱萌，周继陶，等.胃癌中 P53蛋白转录调控活性的分析及其临床意义.中华医学遗传杂志，2010，27:60-65.

2 Gu YM，Ma YH，Zhao WG，et al.Dickkopf3 overexpressioninhibits pancreatic cancer cell growth in vitro.World JGastroenterol，2011，17:3810-3817.

3 Tsai KW，Wu CW，Hu LY，et al.Epigenetic regulation of miR-34b and miR-129 expression in gastric cancer.Int J Cancer，2011，129:2600-2610.

4 Ding WJ，Fang JY，Chen XY，et al.The expression and clinicalsignificance of DNA methyltransferase proteins in human gastriccancer.Dig Dis Sci，2008，53:2083-2089.

5 Yokobori T，Mimori K，Iwatsuki M，et al.p53-Altered FBXW7 expression determines poor prognosis in gastric Cancer cases.Cancer Res，2009，69:3788-3794.

6 Sirak I，Petera J，Hatlova J，et al.Expression of p53，p21 and p16 does not correlate with responseto preoperative chemoradiation in gastric carcinom.Hepatogastroenterology，2009，56:1213-1218.