牛蒡子苷元对人食管癌细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

杜建新，马洪德

(1.平顶山市第二人民医院感染性疾病科 河南平顶山 467000;2.平顶山市第一人民医院 感染性疾病科 河南平顶山 467012)

牛蒡子在体外可抑制胰腺癌、肝癌、白血病等肿瘤细胞的生长［1-4］，牛蒡子苷元(ARG)是牛蒡子的主要活性成分。食管癌临床常见，ARG对人食管癌的作用尚不明了，本研究发现了ARG对人食管癌细胞的作用，为食管癌的治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 EC-1(郑州大学病理实验室提供)，ARG(上海融禾医药科技发展有限公司);RPMI1640培养液，胎牛血清;免疫组化试剂盒;细胞凋亡检测试剂盒;酶标仪、水平电泳仪、流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将EC-1接种于37℃ RPMI1640培养液，置于5%CO2培养箱中培养。2～3 d传代后，取生长对数期细胞用于实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率:取对数生长期EC-1细胞常规消化，用RPMI1640配成单细胞悬液，以每孔104～105个细胞接种于96孔培养板中，培养24 h，实验组加用含不同浓度ARG的培养液，使其终浓度分别为2.5、5、10 mg/L;对照组加培养液。继续培养48 h后，加入MIT溶液，继续孵育4 h，加入DMSO，使结晶物充分溶解。选择570 nm波长，测定各孔光吸收值，计算生长抑制率。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期:取对数生长期细胞，常规制成单细胞悬液，以1.25×105/ml密度接种于培养瓶中，24 h后加入各浓度ARG培养24 h，收集细胞移入离心管中，1 000 r/min离心5 min，用PBS溶液清洗1次，在离心管中留约0.5 ml PBS，加入70%冰乙醇5 ml混匀固定，4℃放置48 h以上。之后离心离去乙醇，PBS清洗1次，在离心管中留1 ml PBS，加入Rnase酶，室温放置30 min。再用50 μg/ml的碘化丙啶(PI)染色后，用流式细胞仪分析细胞周期。

1.2.4 免疫组化检测增殖细胞核抗原:将传代的EC-1以2×105/ml接种12孔培养板，作细胞爬片。细胞生长至80%以上融合度时，加入含0.4%血清的培养液行同步化处理24 h，按上述分组加入不同浓度ARG后继续培养24 h。将培养板孔中的盖玻片取出，PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定10 min，按SP试剂盒操作方法进行免疫组化PCNA检测，DAB显色，同时用PBS代替一抗作阴性对照。判定:IDA-2000数码显微图像分析系统对免疫组化染色切片进行图像分析，以平均吸光度半定量PCNA表达的强度。

1.2.5 流式细胞仪分析凋亡细胞百分率:取EC-1制成1×108/L单细胞悬液，细胞贴壁后分别加入10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L的 ARG，对照组加入培养液，处理24 h后收集细胞;取5×104个重悬的细胞离心后，采用Annexin.VFITC/PI法染色。用流式细胞仪检测，每组重复3次，取平均值。

1.2.6 琼脂糖凝胶电泳和DNA缺口末端标记法检测细胞凋亡:将5×107/L细胞悬液接种于35 mm培养皿中，将用多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片置于培养皿内，37℃，5%CO2培养箱中培养，使细胞自然在盖玻片上贴壁生长。24 h后分别加入10、20、40 mg/L的ARG，对照组加培养液，继续培养48 h。吸弃培养皿内的培养液，37℃PBS轻洗3次，以4%多聚甲醛固定。按照原位凋亡细胞检测试剂盒中说明书进行操作。计数凋亡细胞数目及总细胞数目，并计算细胞凋亡指数。

1.2.7 免疫组化检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达:按照试剂盒说明进行细胞爬片，方法同TUNEL。24 h后，将载玻片取出，PBS洗3次，置于多聚甲醛中固定30 min。PBS洗3次，将载玻片取出置于湿盒中滴加3%过氧化氢溶液，浸泡15 min，然后PBS洗3遍，每次3 min。滴加一抗:分别为1∶50的 Bcl-2和Bax，置湿盒中37℃温浴120 min。弃一抗，PBS漂洗3遍。滴加二抗，置湿盒中室温孵育1 h。PBS漂洗3遍，每次3 min。DAB显色:将现配的DAB染色剂加于载玻片上，室温显色，至阳性棕色颗粒出现，蒸馏水冲洗、苏木素衬染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。用光镜高倍镜下(400倍)观察，每组随机取5张玻片，随机选择5个视野，计算100个细胞的阳性细胞数。

1.3 统计学方法 应用SPSS12.0计算机统计软件进行数据处理，所有数据均用均数±标准差()表示，多组计量资料的比较用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准，P ＜0.05 有统计学差异。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖抑制率 ARG在2.5～10 mg/L浓度范围内对EC-1细胞的增殖抑制作用随着药物浓度逐渐增强，与对照组有统计学差异(P＜0.05)，见表1。

表1 不同浓度的ARG对EC-1增殖的抑制率(%)的影响(n=4，)

表1 不同浓度的ARG对EC-1增殖的抑制率(%)的影响(n=4，)

与对照组相比，△P ＜0.05。

2.2 流式细胞仪检测EC-1细胞周期 不同浓度ARG组G0/G1期细胞百分率较对照组显著增加，S期细胞百分率显著降低，见表2。

表2 不同浓度的ARG对EC-1细胞周期的影响(n=4，)

表2 不同浓度的ARG对EC-1细胞周期的影响(n=4，)

与对照组相比，*P＜0.05。

2.3 牛蒡子苷元对EC-1内PCNA表达的影响 免疫组化染色显示，对照组胞核着色最深，呈棕黄色，实验组随着ARG用量的增加胞核着色逐渐减弱。图像分析结果显示:5 mg/L和10 mg/L ARG组平均吸光度较对照组明显减低(P＜0.05)，见表3。

表3 牛蒡子苷元对EC-1内PCNA表达的影响(n=4，)

表3 牛蒡子苷元对EC-1内PCNA表达的影响(n=4，)

与对照组相比，#P ＜0.05。

2.4 流式细胞仪分析凋亡细胞百分率 10、20、40 mg/L ARG处理EC-1细胞后可见凋亡峰，其凋亡率分别为(2.251 ± 0.165)%、(3.557 ± 0.086)%、(8.087 ±0.064)%，对照组的凋亡率为(1.113 ±0.021)%。ARG处理细胞的凋亡率高于对照组，有统计学差异(P＜0.05)。见表4。

表4 流式细胞仪检测不同浓度ARG处理后EC-1细胞凋亡百分率(n=3，)

表4 流式细胞仪检测不同浓度ARG处理后EC-1细胞凋亡百分率(n=3，)

与对照组比较，◆P＜0.05;★P＜0.01。

2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 经10、20、40 mg/L ARG处理的EC-1细胞进行TUNEL法检测有凋亡细胞出现，其凋亡指数分别为(30.16 ±1.57)%、(70.34 ±0.44)%、(80.43 ±1.31)%，对照组的凋亡指数为(6.27±0.13)%。对照组与任一药物组间比较有统计学差异(P ＜0.05)，见表5。

表5 TUNEL检测不同浓度ARG处理后EC-1 细胞凋亡指数(n=5，)

表5 TUNEL检测不同浓度ARG处理后EC-1 细胞凋亡指数(n=5，)

与对照组比较，◆P＜0.05;★P＜0.01。

2.6 免疫组化检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达 经10、20、40 mg/L ARG处理的EC-1细胞Bax表达明显升高，其阳性表达率分别为(54.54±1.53)%、(80.50 ±1.94)%、(85.42 ±0.74)%，对照组的阳性表达率为(16.14±1.73)%;Bcl-2表达明显减低，其阳性表达率分别为(53.57 ±1.17)%、(13.56 ±1.19)%，对照组的阳性表达率为(84.94±0.85)%，对照组与任一药物组间比较有统计学差异(P＜0.05)，见表6。

表6 ARG对EC-1细胞Bax、Bcl-2表达率的影响(n=5，)

表6 ARG对EC-1细胞Bax、Bcl-2表达率的影响(n=5，)

与对照组比较，◆P＜0.05;★P＜0.01。

3 讨论

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，由于其起病隐匿，确诊时大多为中晚期，患者多无手术及放疗的适应症，化疗亦多无明显效果，研制新型抗癌药物实属必要。中药的细胞毒作用大多小于化疗药物，近年来从天然植物内寻找敏感，且毒副反应小的抗癌活性成分已成为国内外研究的热点。牛蒡子具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗炎、抗病毒、抗菌等作用。ARG为牛蒡子的主要活性成分，对小鼠皮肤癌、大鼠肺癌、肝癌有显著的抑制活性，而对人食管癌细胞的影响报道极少。肿瘤的特征是无限增殖，抑制肿瘤细胞增殖已成抗肿瘤治疗研究的热点，PCNA又称细胞周期蛋白，与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，主要在增殖细胞中合成和表达，是反映细胞增殖状态的良好指标，并可作为细胞增殖的标记［5］，在细胞周期调控方面发挥着重要作用［6］。国内外在许多肿瘤中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展等方面，抑制PCNA的表达可抑制癌细胞的克隆形成能力。本文MTT证实ARG在2.5～10 mg/L浓度范围内可抑制EC-1细胞的增殖，且有剂量依赖性。不同浓度ARG组平均吸光度较对照组均减低，推测ARG具有抑制EC-1细胞增殖的作用。

正常细胞增殖的调控大致分为正调节和负调节。肿瘤是生物体细胞正常生长失去控制的结果，正调节使细胞进入增殖周期，阻止细胞分化，负调节则抑制细胞进入细胞增殖周期。若正负调节失控，则导致肿瘤形成。细胞周期各时相的变化依赖细胞周期蛋白的调控，ARG抑制EC-1细胞增殖的分子机制仍有待于进一步研究。

细胞凋亡是细胞衰老、死亡的一种主动过程，按着一定的程序进行，又称细胞程序性死亡，其过程包括3个阶段:染色质压缩从而呈致密碱性染色，核离散和细胞体积缩小，细胞密度增大。凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化的细胞自杀，由基因控制，它是维持机体正常生理功能和自身稳定的重要机理，是生命过程中不可缺少的内容。现已经认识到许多疾病与细胞凋亡规律失常有关。肿瘤不仅是增殖异常的疾病，而且也是凋亡异常的疾病，目前认为细胞凋亡受抑，打破了正常组织中细胞增殖与凋亡的平衡调节。有研究表明肿瘤促进剂TPA可通过抑制细胞凋亡，促进肿瘤的形成，B细胞淋巴瘤染色体移位激活了Bcl-2基因，抑制细胞凋亡而引发肿瘤。临床上肿瘤放疗化疗的机理之一，即是引发肿瘤细胞凋亡，同时细胞凋亡的检测可作为筛选有效抗癌药物的简便方法，有针对性诱导肿瘤细胞凋亡，从而使正常细胞免受化疗、放疗之害是今后肿瘤治疗的方向。本文的实验表明在加入ARG后的细胞中出现细胞凋亡明显增多;DNA缺口末端标记法检测显示ARG组凋亡细胞数明显增加，根据以上实验发现ARG具有明显诱导EC-1细胞凋亡的作用。

细胞凋亡是由凋亡基因控制的，研究提示［7］细胞内与凋亡相关的基因可分为两大类，即存活基因和致死基因。线粒体膜上Bcl-2和Bax是最重要的一类细胞凋亡调控基因［8］。Bcl-2基因不同于其他的抑癌基因，可加速细胞分裂、细胞增殖，维持细胞生存，延长细胞寿命，导致细胞数增加。Bcl-2具有抗凋亡的作用，Bax具有促细胞凋亡的作用。Bcl-2与肿瘤的发生密切相关，Bcl-2可抑制多种因素引起的细胞凋亡，其抑制细胞凋亡的机制有以下几种可能:①作为一种抗氧化剂，调节细胞的氧化还原状态;②与Bax结合成异源二聚体，抑制Bax的促凋亡作用;③影响细胞钙离子的重新分布、钙离子激活内源性的内切酶和谷氨酰胺转移酶;④抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆，细胞色素C是促进凋亡的。Bcl-2抑制细胞凋亡必须与Bax形成异源二聚体来实现。本文研究显示ARG组EC-1细胞内Bcl-2蛋白减少，而Bax蛋白较对照组明显增高，表明ARG促进了EC-1细胞凋亡。其机理与Bax/Bax比例大于Bcl-2/Bax有关，从而导致细胞发生凋亡，抑制了肿瘤细胞的生长。因此，深入研究ARG对食道癌细胞增殖与凋亡的作用，将为ARG作为潜在的抗肿瘤药物提供实验依据。

［1］郑国灿.牛蒡子苷对胰腺癌细胞抑制作用及其作用机理的实验研究［J］.时珍国医国药，2008，19(10):2384-2386.

［2］郑国灿，王兵，钱程佳，等.牛蒡子苷元对肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨［J］.山东医学，2011，51(14):13-15.

［3］Yao X，Zhu F，Zhao Z，et al.Arctigenin enhances chemosensitivity of cancer cells to cisplatin through inhibition of the STAT3 signaling pathway［J］.J Cell Biochem，2011，112(10):2837-2849.

［4］Guirong C，Liping C，Deqiang D，et al.Synthesis of(-)-arctigenin derivatives and their anticancer activity［J］.Net Prod Res，2011，26(12)，177-181.

［5］Paunesku T，Mittal S，Protic M，et al.Proliferating cell nuclear antigen:ringmaster of the genome［J］.Int J Radiat Biol，2001，77(10):1007-1021.

［6］QemeneIIr L，Gerland L M，Flacher M，et al.Differential control of cell cycle，proliferation，and survival of primary T lymphocytes by purine and pyrimidine nucleotides［J］.J Immuol，2003，170(10):4986-4995.

［7］Petit P X，Zanmami N，Vayssiere J L，et al.Implication of mitochondria in apoptosis［J］.Mol Cell Biochem，1997，174(1-2):185-188.

［8］Cory S，Huang D C，Adams J M.The Bcl-2 family:roles in cell survival and oncogenesis［J］.Oncogene，2003，22(53):590-607.