头孢拉宗与两种氨基糖苷类抗菌药物联用对11株双产酶阴沟肠杆菌的联合药敏研究

孙 艳，王 沭，邵晓迪，白 艳，王 睿（. 解放军总医院药品保障中心，北京 0085；. 总后司令部管理保障局第三门诊部，北京 0009；. 解放军总医院药物临床研究中心，北京 0085）

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae, EC）广泛存在于自然界中，是人体肠道正常菌群之一，为常见的条件致病菌，既可通过外源性引起感染，也会由于机体免疫力降低，不合理使用抗菌药物而引发内源性感染，引起呼吸道、尿道、伤口感染及败血症等[1-3]。阴沟肠杆菌产AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因，少数的阴沟肠杆菌还会产碳青霉烯酶，或同时产生以上酶从而导致多重耐药[4-5]，给临床治疗此类感染带来极大挑战。头孢拉宗（cefbuperazone, CBPZ）是日本富山化学工业制药株式会社研发的头孢类抗菌剂，1985年首次在日本上市。头孢拉宗是第三代头霉素类抗菌药物，对多种革兰阴性菌具有较高的抗菌活性，具有7α-甲氧基取代基的头霉素结构，使其对β-内酰胺酶稳定，对产β-内酰胺酶的细菌也有一定的抗菌活性。其作用机制与其他头孢菌素类抗菌药物相似，主要通过抑制细菌细胞壁的合成从而发挥杀菌作用[6]。虽然头孢拉宗对产AmpC酶阴沟肠杆菌有效，但是对双产酶阴沟肠杆菌尚不能完全抑制。氨基糖苷类药物是具有氨基糖与氨基环醇结构的一类抗生素，临床上主要用于治疗敏感需氧革兰阴性杆菌所致的全身感染。阿米卡星（amikacin, AMKC）、异帕米星（isepamicin,IPMC）均为氨基糖苷类抗菌药物，对多数肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、变形杆菌属等具有良好的抗菌作用。其对许多肠道革兰阴性杆菌所产生的氨基糖苷类钝化酶稳定，不会被此类酶钝化而失去抗菌活性，交叉耐药性少，而且这两种抗生素与β-内酰胺类抗菌药物等联用具有协同作用。

因此，本实验通过研究头孢拉宗分别与阿米卡星和异帕米星对临床分离的11株双产酶阴沟肠杆菌的体外联合抗菌效应，探讨联合应用头孢拉宗与阿米卡星或异帕米星是否显示协同作用，以期为临床控制产酶阴沟肠杆菌的感染，合理联用抗菌药物时提供一定的实验依据。

1 材料

1.1 菌株来源

11株来自中国人民解放军总医院2011年3月的阴沟肠杆菌非重复临床分离菌株，全部来源于住院患者送检的痰液临床标本，采用双纸片法检验，经鉴定为产ESBLs和AmpC酶阴沟肠杆菌。标准质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922（中国药品生物制品检定所）。

1.2 培养基

Mueller-Hinton Broth（MH）营养肉汤（北京奥博星生物技术有限责任公司）；Mueller-Hinton Agar（MH）培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

1.3 抗菌药物

头孢拉宗（韩诺株式会社，规格：0.2 g，批号：1026145）；阿米卡星（中国药品生物制品检定所，规格：100 mg，批号：130335-200204）；硫酸异帕米星注射液（旭化成制药株式会社，规格：200 mg/2 mL，批号：EXA11CY）

1.4 仪器

比浊仪（法国梅里埃公司）；连续微量加样器（美国Eppendorf公司）；八导微量加样器（美国Eppendorf公司）；96孔平板（爱思进医用塑料（台州）有限公司）。

2 方法

2.1 菌悬液的配制

从已分纯并过夜新鲜培养的细菌平板上挑取4 ～5个菌落，接种于MH肉汤中增菌6 h（恒温，震荡培养）。菌液用3 mLMH肉汤校正比浊仪浊度至0.5 MacFarland，再用MH肉汤稀释至1. 5×105cfu·mL-1。

2.2 抗菌药物储备液的配制

精密称取适量头孢拉宗和阿米卡星，根据美国临床实验室标准化委员会CLSI（2012）以相应溶剂溶解，25 mL容量瓶中定容，含药储备液浓度均为1024 μg·mL-1，然后进行分装冷藏，备用。硫酸异帕米星注射液直接分装，配成1024 μg·mL-1含药储备液，冷藏备用。

2.3 测定方法

2.3.1 最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）的测定 用微量肉汤稀释法测定单个药物的MIC，以CLSI（2012）标准判读敏感性；同时计算MIC范围，半数抑菌浓度（MIC50），90%抑菌浓度（MIC90）和抑菌浓度几何均数（MICG）。

2.3.2 FIC的测定 将头孢拉宗以灭菌MH肉汤倍比稀释成11个浓度，分别为256，128，64，32，……，0.5 μg·mL-1；阿米卡星和异帕米星以灭菌MH肉汤倍比稀释成7个浓度，分别为16，8，4，2，……，0.25 μg·mL-1。将不同浓度的两种抗菌药物按棋盘法设计，两两组合加入96孔平板中，每种抗菌药物取50 μL，再将1.5×105cfu·mL-1的菌液100 μL加入孔中，头孢拉宗的最终浓度为64，32，16，8，……，0.125 μg·mL-1；阿米卡星和异帕米星的最终浓度为4，2，1，0.5，……，0.062 5 μg·mL-1；菌悬液最终浓度为7.5×104cfu·mL-1，37 ℃过夜（20±2） h培养。观察结果，记录单独应用两药的最低抑菌浓度MIC甲药单用和MIC乙药单用，并选择最佳组合效应时，两药联合时各自的MIC甲药联用和MIC乙药联用，以计算FIC指数。

2.4 结果判定标准

2.4.1 MIC结果判定标准 采用微量肉汤稀释法进行抗菌药物最低抑菌浓度测定，无菌生长96孔平皿的最低药物浓度为该药对该株细菌的MIC。双产酶阴沟肠杆菌对头孢拉宗、阿米卡星和异帕米星的折点结果判定及质控菌ATCC25922质控范围参考国外文献及CLSI（2012）见表1。质控跟随每批实验，以确保整个实验的准确性。

2.4.2 FIC指数的计算与判定标准[7]FIC指数 =MIC甲药联合/MIC甲药单用+ MIC乙药联合/MIC乙药单用。FIC≤0.5，协同作用；0.5 ＜ FIC ＜ 1，部分协同作用；FIC = 1，相加作用；1 ＜ FIC≤4，无关作用；FIC ＞ 4，拮抗作用。

表1 抗菌药物MIC判定标准. μg·mL-1Tab 1 Interpretive standards for the values of MIC of antibacterials. μg·mL-1

3 结果

3.1 头孢拉宗、阿米卡星和异帕米星单用对11株双产酶阴沟肠杆菌的MIC及耐药性

头孢拉宗对双产酶阴沟肠杆菌的MIC50和MIC90分别是32 μg·mL-1和128 μg·mL-1，敏感率为45.45%，耐药率为27.27%；阿米卡星对双产酶阴沟肠杆菌的MIC50和MIC90分别是2 μg·mL-1和4 μg·mL-1，异帕米星对双产酶阴沟肠杆菌的MIC50和MIC90分别是0.25 μg·mL-1和1 μg·mL-1，敏感率高，且均为90.91%，耐药率也相同，均为9.09%。具体见表2。

表2 头孢拉宗、阿米卡星和异帕米星单用对双产酶阴沟肠杆菌MIC及耐药性. n = 11，μg·mL-1Tab 2 The results of MIC and drug resistance on CBPZ or AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae.n = 11，μg·mL-1

3.2 头孢拉宗与阿米卡星、异帕米星单用和联用对11株双产酶阴沟肠杆菌的MIC

单用头孢拉宗对11株双产酶阴沟肠杆菌的MIC50为32 μg·mL-1，联用阿米卡星时，MIC50下降到4 μg·mL-1，联用异帕米星时，MIC50下降到2 μg·mL-1。单用阿米卡星对11株双产酶阴沟肠杆菌的MIC50为2 μg·mL-1，异帕米星的MIC50为0.25 μg·mL-1；与头孢拉宗联用，阿米卡星的MIC50下降到0.5 μg·mL-1，异帕米星的MIC50下降到0.125 μg·mL-1。具体见表3。

3.3 头孢拉宗与阿米卡星或异帕米星联合应用FIC指数分布

头孢拉宗与阿米卡星联用时，FIC≤0.5占27.27%，0.5 ＜ FIC ＜ 1占27.27%，FIC = 1占36.36%，1 ＜ FIC≤4占9.1%，FIC ＞ 4为0，说明头孢拉宗与阿米卡星联用对11株双产酶阴沟肠杆菌多数以相加作用为主，无关较少，无拮抗作用；头孢拉宗与异帕米星联用时，FIC≤0.5占27.27%，0.5 ＜ FIC ＜ 1占54.55%，FIC = 1占9.09%，1 ＜ FIC≤4占9.09%，FIC＞ 4为0，说明头孢拉宗与异帕米星联用对11株双产酶阴沟肠杆菌以部分协同作用为主，相加和无关作用较少，无拮抗作用。具体见图1。

表3 头孢拉宗与阿米卡星、异帕米星单用和联用对双产酶阴沟肠杆菌的MIC值. n = 11，μg·mL-1Tab 3 The values of MICs of CBPZ alone or combined with AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae.n = 11，μg·mL-1

图1 联合抗菌药物的FIC指数分布. n = 11Fig 1 The percent distribution of FIC of CBPZ and AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae. n = 11

3.4 头孢拉宗与阿米卡星、异帕米星单用和联用对11株双产酶阴沟肠杆菌的浓度-累积抑菌百分率曲线

与单用相比，头孢拉宗与阿米卡星和异帕米星联用的累积抑菌百分率曲线明显左移，表明在相同累积抑菌百分率下，两药联合应用比两药单独应用所需的药物浓度低；在相同的给药浓度下，联合用药比单独用药具有更高的抗菌效应。具体见图2和图3。

图2 头孢拉宗与阿米卡星单用和联用对双产酶阴沟肠杆菌的浓度-累积抑菌百分率曲线Fig 2 The concentration accumulated inhibition percentage curve of the antibacterial activity of CBPZ combined with AMKC against distocia enzyme Enterobacter cloacae

图3 头孢拉宗与异帕米星单用和联用对双产酶阴沟肠杆菌的浓度-累积抑菌百分率曲线Fig 3 The concentration accumulated inhibition percentage curve of the antibacterial activity of CBPZ combined with IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae

4 讨论

近年来，双产酶阴沟肠杆菌不仅对除碳青霉烯类外的其他β-内酰胺类抗菌药物耐药率极高，对非β-内酰胺类抗菌药物如庆大霉素、阿米卡星和环丙沙星的耐药性也显著高于单纯高产AmpC酶或单纯产ESBLs的阴沟肠杆菌，其多重耐药性非常严重。

头孢拉宗是第三代头霉素类抗菌药物，抗菌谱有所扩大，耐酶性强，对多种革兰阴性菌具有较高的抗菌活性，特别是对大肠埃希菌、克雷伯菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属、沙雷菌属和吲哚阳性变形杆菌有良好的抗菌力。其对革兰阴性菌的体外抗菌活性大多优于头孢西丁、头孢美唑等。头孢拉宗对各种细菌产生的β-内酰胺酶极为稳定，对β-内酰胺酶产生菌也有强大的抗菌作用。

异帕米星是庆大霉素B的1-N-HABA衍生物，具有与阿米卡星相似的抗菌活性，适用于治疗对其他氨基糖苷类药物、包括对阿米卡星耐药的革兰阴性杆菌（包括双产酶阴沟肠杆菌）和葡萄球菌所致的严重感染[8-9]。异帕米星具有显著的抗生素后效应，维持并加强了氨基糖苷类药物的优势，具有强效杀菌活性、致耐药性低以及毒副作用小和具有良好的抗生素后效应等特点，广泛用于各类细菌感染的治疗。

本研究对11株双产酶阴沟肠杆菌的体外联合药敏实验结果表明，头孢拉宗与阿米卡星或异帕米星联用可显著降低单独应用时的MIC，联合应用后比单独应用时的浓度-累积抑菌百分率曲线明显左移，效应增强，以部分协同和相加作用为主,说明两种药物联用对双产酶阴沟肠杆菌具有较好的体外抗菌活性。因此，在治疗由双产酶阴沟肠杆菌导致的感染时，可以考虑采用头孢拉宗与阿米卡星或异帕米星联合应用。

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