云南大理地区恙虫病血清学诊断及病原体基因序列分析

亚红祥，王静林

恙虫病（tsutsugamushi disease）又称丛林斑疹伤寒（scrub typhus），是由恙虫病东方体（Oreintia tsutsugamushi，Ot）引起的急性传染病，该病常引起多器官损害，临床表现复杂多变，容易误诊［1］。云南为恙虫病的主要流行省份，近年恙虫病病例增多［2］。国际上恙虫病已被认为是威胁旅游健康的重要传染病之一，随着云南生态旅游的日益发展，该病已成为我省一个重要的公共卫生问题。为了明确我省恙虫病病原体的类型，我们应用血清学方法对云南大理地区恙虫病病例进行血清学诊断，并对病原体做基因序列分析。

1 材料与方法

1．1 材料 2010年2月—12月收集到当地各医疗机构送检的云南大理地区不明原因持续发热≥3天的病人血液19份，每份样本取一部分全血进行低速离心分离血清用于血清抗体检测，另一部分全血用于核酸提取。

1．2 方法

1．2．1 间接免疫荧光试验（IFA）用PBS从1∶20开始对被检样本血清作系列稀释至1∶320，将各稀释度血清分别加到Ot Karp型和Kato型抗原片（中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供）孔内，放入湿盒置37℃孵育45min，用PBS洗片3次，每次1～2min，吹干，加入荧光素标记的羊抗人IgG抗体（KPL公司），放入湿盒置37℃孵育30min，用PBS洗片3次，每次1～2min，吹干，用Nikon荧光显微镜观察结果。荧光明亮，呈黄绿色，病原体均匀分布，即可判定该滴度为阳性。

1．2．2 巢式PCR（nPCR）检测 用 QIAGEN 公司DNA提取试剂盒对患者血液提取总DNA，应用文献 中的引物（表1）及条件对Ot groEL 和sta56基因进行扩增，引物由上海生工公司合成。PCR反应总体积为25μL，应用Promega公司 Go－TaqGreen Master Mix试剂盒在Biometra TProfessional PCR仪中进行二次PCR扩增，以无菌水作为阴性对照，无阳性对照。第一次扩增时取6μL被检标本DNA为模板，第二次扩增时取第一次扩增产物1μL作为模板。取二次PCR产物用1．5%琼脂糖凝胶检测，DNA标准为DL2000（Takara公司）。

1．2．3 DNA序列测定及分析 PCR阳性产物送北京博迈德科技发展有限公司进行序列测定。将所得到的序列通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心（www．ncbi．nlm．nih．gov）站点后，利用BLAST工具以及采用DNAStar中的MegAlign软件对序列进行同源性比较，运用MEGA5．0软件构建系统进化树。

表1 Ot检测所用引物序列Tab．1 Primers’sequences for detection of Ot

2 结 果

2．1 病例资料 收集到病例19份资料（编号DL1－19），均有不明原因发热，发热时间在3～24d，体温在38～41℃，伴有全身酸痛7例、焦痂2例（DL1患者左腿腘窝处焦痂，见图1），有的还伴咳嗽、咳痰、鼻出血、胃出血、尿少等；其中农民15例、学生2例、其他2例，男：女性别为11／8，年龄在8～63岁。

2．2 IFA检测 对19例患者血清进行Ot IgG抗体检测，以效价1∶40作为阳性参考值，结果Karp型阳性7例，效价在1∶160－1∶40；Kato型阳性4例，效价在1∶320－1∶40；两型均阴性11例；两型均阳性3例，其中DL1样本两型效价均达1∶160（表2）。

图1 特异性焦痂Fig．1 Specific eschar

2．3 groEL基因检测及序列分析 对19例患者血液进行nPCR Ot groEL 基因检测，结果 DL1、DL4和DL5共3份扩增到364bp大小的目的片断（图2和表2）。

图2 nPCR扩增groEL片断部分结果Fig．2 Partial result of nPCR detection by Ot groELsegment specific primersM：DL2000DNA marker；1：DL1；2：DL2；3：DL3；4：DL4；5：DL5；6：DL6；7：DL7；8：DL8；9：DL9；10：DL10．

表2 Ot抗体及groEL片断检测结果Tab．2 Detection results for Ab and groELsegment of Ot

从DL1、DL4和DL5样本中扩得的Ot groEL基因测序，将其序列进行比较，结果3者之间的同源性为100%。

应用BLAST工具将该测定序列（321bp）与GenBank中已知序列进行同源性比较，结果该序列与 AH－GD－OT－S6（GQ499933）、Karp （M31887）、ZJ－TT－OT－O21（GQ499953）、UT332（EF551306）的同源性均为100%；与Kato（AY191586）的同源性为99%； 与 Kawasaki （AY191587）、 Gilliam（AY191585）的同源性分别为94%、93%。

2．4 sta56基因检测及序列分析 对DL1样本应用群特异引物nPCR检测Ot sta56基因，结果扩增到481－507bp大小的目的片断，应用BLAST工具将测序获得的样本DL1序列（459bp）与GenBank中已知序列进行同源性比较，结果DL1序列与台湾株 KM05（GU120150）、HL04（GU120144）、TW45R（AY222632）、 KM17－2 （GU446600） KM18（GU446601）的同源性最高均为99%；与Karp株（M33004）的同源性为93%；与中国山东Shandong－XDM2（DQ514320）、TWZ（JX202573）株的同源性均为78%，与Kato（M63382）株的同源性为77%。

对DL1样本应用分型引物nPCR检测Ot sta56基因，结果扩增到230bp大小的Karp型sta56基因目的片断（图3），应用BLAST工具将测序获得的样本DL1序列与GenBank中已知序列进行同源性比较，结果 DL1序列（216bp）与台湾株 KM05（GU120150）、HL04（GU120144）、TW45R（AY222632）、KM17－2（GU446600）KM18GU446601的同源性均为100%，与Karp株（M33004）的同源性为91%。

图3 分型引物nPCR检测DL1样本结果Fig．3 Results of DL1by nPCR with Karp and Kato specific primersM：DL2000DNA marker；1：Karp；2：Kato

2．5 系统进化树分析 根据Ot groEL 基因部分序列进行系统进化树分析，结果显示样本DL1序列（321bp）与 AH－GD－OT－S6（GQ499933）、Karp（M31887）、ZJ－TT－OT－O21（GQ499953）、UT332（EF551306）、Kato（AY191586）株在同一个分支上（图4）。

根据Ot sta56基因部分序列进行系统发生树分析，结果显示样本DL1序列（据群特引物检测Ot sta56片断所获得459bp大小的序列）与台湾KM05（GU120150）、HL04（GU120144）、TW45R（AY222632）、 KM17－2 （GU446600）、 KM18（GU446601）株在同一个分支上，见图5。

图4 根据Ot groEL基因部分序列构建的系统进化树Fig．4 Phylogenetic tree of partial segments of Ot groELgene

图5 根据Ot sta56基因部分序列构建的系统进化树Fig．5 Phylogenetic tree of partial segments of Ot sta56gene

2．6 恙虫病病例诊断 根据恙虫病预防控制技术指南［7］，结合患者临床发病情况和实验室检测结果进行综合分析，恙虫病患者共8例：其中实验室确诊4例（其中2例Ot核酸阳性且抗体效价≥1∶160、1例Ot核酸阳性且抗体效价1∶40、1例Ot抗体效价1∶160）、临床诊断病例4例（Ot抗体效价在1∶80～1∶40）；Karp血清型4例、Kato血清型3例、Karp＋Kato血清型1例；农民7例、学生1例；春季3例、夏季2例、秋季2例、冬季1例。

3 讨 论

恙虫病是由恙虫病东方体引起的自然疫源性疾病，以鼠类为主要传染源，经恙螨叮咬而传播，临床上以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大、肝脾肿大及皮疹为特征，全身毒血症状可致多脏器受累，甚至死亡［8］。恙虫病在我国分布广泛，近年全国流行态势呈上升趋势［9］。云南作为恙虫病流行的主要省份之一，其病例也在逐年增多，主要分布于保山、大理、西双版纳等滇西南地区，全年均有发病，以夏秋季为主，农民居多，且高度散发，误诊率高达80%［2］。以往多采用血清学方法对Ot进行鉴定，近年许多省份和地区均有应用RFLP、PCR技术及核苷酸序列分析等技术对Ot进行基因序列鉴定［9］，然而云南对Ot的研究较少，特别是型别鉴定及序列分析尤为滞后。本次采用WHO推荐的恙虫病标准诊断方法IFA［10］以及nPCR与序列分析技术进行恙虫病病例诊断，确诊恙虫病8例。其中2例有特异性焦痂，占总病例的25%，低于以往本省恙虫病焦痂发生率30～80%［2］；8例确诊恙虫病病例中7例患者为农民，符合该病以农民居多的特点；春季3例、夏季2例、秋季2例、冬季1例，这也符合本省恙虫病全年均有发病的特点。以往研究显示大理地区恙虫病患者以Karp血清型多见、Kato血清型甚少［11］，而本次研究发现该地区8例确认的恙虫病中，Karp血清型4例和Kato血清型3例，Karp＋Kato混合血清型1例。该结果说明大理地区存在Karp和Kato血清型恙虫病东方体，以及可能某些患者为Karp和Kato血清型恙虫病东方体的混合感染。

Ot 58kD蛋白较为保守，其编码基因groEL常用于Ot的筛查，而56kD蛋白具有型或株特异性，sta56为其编码基因通常应用于Ot的型别鉴定。本次研究通过nPCR检测到groEL基因目的片断3例（检出率15．79%，同时它们的Ot抗体也检测阳性），序列系统进化树分析显示该3株Ot均与Karp、AH－GD－OT－S6 （GQ499933）、ZJ－TT－OTO21、UT332、Kato株在同一个分支上，表明该方法不能区分出Ot的血清型别。从Karp＋Kato混合血清型样本扩得sta56基因片断，其序列（216bp）分析结果表明该Ot株的遗传进化关系与台湾KM05、HL04、TW45R、KM17－2、KM18株最为密切，而与Karp株的关系较远；群引物检测到sta56基因片断，其序列（459bp）系统进化树分析显示该Ot株与台湾 KM05、HL04、TW45R、KM17－2、KM18株在同一个分支上，而与Karp株不在同一分支，再次表明该Ot株的遗传进化关系与台湾KM05、HL04、TW45R、KM17－2、KM18株最为密切，与 Karp株关系较远。

云南省大理地区为我国旅游胜地，该地区地形地貌复杂、植被丰富、鼠类和恙螨繁多［12－13］，是恙虫病流行较为严重的地区，人们深受该病的危害。随着当地旅游业等人类活动的日益扩张，可致使一些恙虫病疫源地的微环境发生改变，Ot可能发生一定的基因变异而出现新的基因型，使恙虫病的流行可能呈现更为复杂多样化，不仅对旅游健康构成威胁，而且会对当地经济产生明显的负面影响。因此为了加强当地恙虫病的预防与控制，开展Ot的基因型别、毒力及其遗传特征等方面的研究具有重要的现实意义。

［1］Tamura A，Ohashi N，Urakami H，etal．Classification of Rick－ettsia tsutsugamushi in a new genusOreintiagen．nov．as Oreintia tsutsugamushi comb．Nov［J］．Int J Syst Bacteriol，1995，45（3）：589－591．DOI：10．1099／00207713－45－3－589

［2］Xuan Q，Liu AH，Bao FK．Current progress in research of tsutsugamushi disease in Yunnan Province in China［J］．Chin Trop Med，2010，10（10）：1278－1280．（in Chinese）宣群，柳爱华，宝福凯．云南恙虫病研究概况［J］．中国热带医学，2010，10（10）：1278－1280．

［3］Zhang LJ，Li XM，Zhang DR，etal．Molecular epidemic survey on co－prevalence of scrub typhus and marine typhus in Yuxi city，Yunnan province of China［J］．Chin Med J（Engl），2007，120（15）：1314－1318．

［4］Park HS，Lee JH，Jeong EJ，etal．Rapid and simple identification oforeintia tsutsugamushi from other group rickettsia by duplex PCR assay using groELgene［J］．Micro Immunol，2005，49（6）：545－549．

［5］Furuya Y，Yoshida Y，Katayama T，etal．Serotye specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA by nested polymerase chain reaction［J］．J Clin Microbiol，1993，31（6）：1637－1640．

［6］Tamura A，Yamamoto N，Koyama S，etal．Epidemiological survey oforeintia tsutsugamushi distribution in filed rodents in Saitama prefecture，Japan，and discovery of a new type［J］．Microbial Immunol，2001，45（6）：439－446．

［7］Chinese Center for Disease Control and Prevention．Tsutsugamushi disease prevention and control technical manual（Pilot Edition）［Z］．2009－1．（in Chinese）中国疾病预防控制中心．恙虫病预防控制技术指南（试行）［Z］．中疾控疾发，2009－1．

［8］Koh GC，Maude RJ，Paris DH，etal．Diagnosis of scrub typhus［J］．Am J Trop Med Hyg，2010，82（3）：368－370．DOI：10．4269／ajtmh．2010．09－0233 9Zhang MWang XJZhao ZT．Current epidemic status and issues on prevention and control of scrub typhus［J］．Chin J Epidemiol，201l，32（4）：419－423．DOI：10．3760／cma．j．issn．0254－6450．2011．04．021 （in Chinese）张萌，王显军，赵仲堂．中国恙虫病流行态势及预防控制［J］．中华流行病学杂志，2011，32（4）：419－423．DOI：10．3760／cma．j．issn．0254－6450．2011．04．021

［10］Blacksell SD，Bryant NJ，Paris DH，etal．Scrub typhus serologic testing with the indirect immuno－fluorescence method as a diagnostic gold standard：a lack of consensus leads to a lot of confusion［J］．Clin Infect Dis，2007，44（3）：391－401．DOI：10．1086／510585

［11］Feng XG，Yuan QH．Detection of antibody against tsutsugamushi disease from sera provided by fever patients and research of it＇s classification in Dali city of Yunnan Province［J］．Chin J Zoonoses，1999，15（3）：74．（in Chinese）冯锡光，袁庆虹．大理市发热病人血清恙虫病抗体检测及其分型研究［J］．中国人兽共患病杂志，1999，15（3）：74．

［12］Niu AQ，Guo XG，Men XY，etal．Community structure of chigger mites on small mammals in the surrounding areas of Erhai Lake in Dali of Yunnan［J］．Chin J Vect Bio Ctrl，2005，16（6）：434－437．（in Chinese）牛爱琴，郭宪国，门兴元，等．云南省大理洱海周边地带小兽体表恙螨群落结构［J］．中国媒介生物学及控制杂志，2005，16（6）：434－437．

［13］Gong ZD，Wu HY，Duan XD，etal．The species diversity and distribution trends of small mammals in Hengduan Mountains，Yunnan［J］．Biodiversity Sci，2001，9（1）：73－79．（in Chinese）龚正达，吴厚永，段兴德，等．云南横断山区小型兽类物种多样性与地理分布趋势［J］．生物多样性，2001，9（1）：73－79．