丝瓜络对慢性心力衰竭大鼠心肌钙调蛋白mRNA表达的影响

房春燕 蒲旭辉 孙文启 许莉莉 韩慧蓉 王 辉 康 白

(潍坊医学院应用药理学实验室，山东 潍坊 261053)

中医药在心衰防治领域取得了很大进展。丝瓜络(RLF)是葫芦科植物丝瓜的干燥成熟果实维管束。本室近期工作证明:RLF对慢性心力衰竭(CHF)大鼠的血流动力学具有明显改善作用〔1〕。但国内外尚无RLF影响心功能的机制报道，本研究通过复制心衰模型，采用RT-PCR技术，系统观察RLF对心衰大鼠心脏钙调蛋白(CaM)基因表达的影响，以明确心衰时CaM的变化，从基因水平、钙调节的角度初步探讨RLF干预CHF，是否与调节CaM mRNA水平有关，为抗心衰中药的研发和开发研究RLF的药理作用及新的临床用途提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 戊巴比妥钠，为国药集团化学试剂有限公司产品，批号20041117;异丙肾上腺素，购自上海禾丰药业有限公司，批号080702;丝瓜络水煎剂(自制);RNA提取试剂盒Rneasy MiniKit，德国QIAGEN公司;TaqMan逆转录试剂盒，美国PE公司;SYBRTM Green PCR Core Reagents试剂盒，美国PE公司;PCR引物由上海生工生物技术服务有限公司合成;5700型定量基因分析仪，美国PE公司;琼脂糖，加拿大BBI公司;GENE GENIUS数码凝胶成像仪，英国SYNGENE公司。

1.2 动物 健康成年Wista大鼠40只，体质量(220±20)g，雌、雄各半，购自山东鲁抗医药股份有限公司动物中心，实验动物生产许可证号:SCXK(鲁)2008 0002。随机分为对照组，模型组，RLF小剂量组和RLF大剂量组。自由饮食饮水，自然光照，单笼饲养。

1.3 实验方法

1.3.1 造模、给药及取材 除对照组外，其余各组参照蒲旭辉等〔1，2〕改良的异丙肾上腺素皮下注射法制备CHF模型。具体操作为大鼠皮下多点注射异丙肾上腺素，第1天20 mg/kg，第2天 10 mg/kg，第 3 天 5 mg/kg，然后以 3 mg·kg-1·d-1剂量连续用药9 d。用药期间观察大鼠毛色、食欲、活动情况等心衰症状。RLF小、大剂量组分别给予RLF水煎剂5、10 g·kg-1·d-1，对照组和模型组则给予等量生理盐水，灌胃给药，连续用药28 d。于末次灌胃后，禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，打开胸腔，迅速取其心尖部组织约50 mg，放入冻存管，并立即置于液氮中固定，然后转入低温冰箱-70℃保存备用。

1.3.2 RT-PCR检测心脏CaM mRNA的表达 从GenBank中查出大鼠CaM和β-actin的mRNA序列，并参考相关文献，利用美国PE公司引物设计软件Primer Express设计专一性引物，见表1，并由上海生工生物工程公司合成。将冻存的各组大鼠心尖部组织标本称重，每个取约20 mg，按照RNA提取试剂盒Rneasy MiniKit(QIAGEN，Germany)说明书提取总 RNA。取5 μg总 RNA，按照 TaqMan 逆转录试剂盒(PE，USA)说明书进行逆转录反应。用oligo d(T)为引物，加入50 μl逆转录反应体系中，于25℃孵育10 min，37℃逆转录反应60 min，70℃逆转录灭活10 min。取逆转录产物4 μl，150 nmol/L上下游引物，加入25 μl反应体系中，用SYBR®Green PCR Core Reagents试剂盒(PE，USA)扩增cDNA样品。首先50℃孵育2 min，95℃激活酶 10 min，然后以 95℃ 变性15 s，61℃ 退火 30 s，72℃ 延伸10 min，循环 40 次(GeneAmp 5700®，Perkin Elmer)。取 RTPCR产物10 μl，于2%琼脂糖凝胶，5 V/cm恒压电泳50 min，用Gene genius Bio-imaging system数码成像分析系统对琼脂糖凝胶进行观察并拍照。根据各组大鼠心脏CaM mRNA表达产物的Ct值，以β-actin为内参照，计算每一样品对应其内参的相对含量。为了避免实验操作过程中的误差，以及所取心脏组织重量不同所带来的误差，以大鼠CaM与β-actin DNA扩增产物量Ct值的比值，即Ct CaM/Ct β-actin，来衡量RLF对大鼠心肌CaM mRNA表达水平的影响，该比值越低，表明组织中CaM mRNA的表达越强烈。

表1 RT-PCR所用引物序列

2 结果

图1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

2.1 特异性扩增产物 通过琼脂糖凝胶电泳核实扩增产物长度，并检验有无特异性扩增。心脏CaM mRNA RT-PCR产物电泳图像证明，对照组、模型组、RLF各组在115 bp和134 bp处各可见一清晰的电泳条带，与预期的CaM mRNA(115 bp)和βactin mRNA(134 bp)基因片段长度一致，证明所扩增片段为特异性扩增，见图1。

2.2 心肌CaM mRNA的表达 与对照组相比，模型组大鼠心脏Ct CaM/Ct β-actin明显降低(P＜0.05)，说明模型组大鼠心肌细胞CaM mRNA的表达显著高于对照组。与模型组相比，RLF大剂量组大鼠心脏 Ct CaM/Ct β-actin明显升高(P＜0.05)，说明RLF可使CaM mRNA的表达显著下调。而RLF小剂量组对大鼠心肌CaM mRNA表达水平的影响无显著差异(P ＞0.05)，见表2。

表2 RLF对心衰大鼠心肌CaM mRNA表达的影响(± s，n=8)

表2 RLF对心衰大鼠心肌CaM mRNA表达的影响(± s，n=8)

与对照组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 Ct CaM Ct β-actin Ct CaM/Ct β 18.545±0.921 15.973±0.626 1.158±0.033模型组 14.595±0.369 14.422±0.623 1.017±0.0191)丝瓜络小剂量组 14.358±0.528 14.432±0.529 1.000±0.019丝瓜络大剂量组 16.403±0.517 14.758±0.379 1.113±0.0282)-actin对照组

3 讨论

随着对心衰病理生理学的深入研究，心衰时心肌细胞的Ca2+传递功能是否发生改变，从而影响心肌功能，已被广泛关注。心肌细胞Ca2+循环异常在心衰的发病中占有重要地位〔3〕，心衰时心肌细胞内存在钙超载状态〔4〕。Ca2+是一种重要的参与细胞内信号转导的第二信使，是兴奋-收缩耦联的关键物质。心衰发生时，衰竭心肌的钙稳态遭到破坏，进而影响心肌的收缩和舒张功能。很多药物通过影响细胞内Ca2+而发挥其药理效应，故细胞内Ca2+的调控及其作用机制近年来受到极大重视。CaM是一种广泛分布于细胞内的钙结合蛋白，通过ApoCaM和Ca2+/CaM两种形式影响细胞内钙调控系统〔5，6〕，参与心肌细胞内Ca2+浓度的调节和钙稳态的维持〔7，8〕。目前认为CaM表达的变化与心衰发生时心功能的异常密切相关〔9～11〕。

近年来，随着临床、实验研究的不断深入，中医药治疗心衰，在改善症状、提高生存质量、多靶点治疗、减少不良反应等方面显示了其特色与优势。因此对抗心衰中药的研究有着非常重要的理论意义和临床价值。RLF具有通经活络、祛风活血，化痰行气等功效。黎炎等〔12〕的研究结果表明，RLF中含有多种化学成分，其中包含苷类(皂苷、强心苷)。甙类对心血管的作用主要表现在调节血脂和影响心功能两个方面。李菁等〔13〕研究显示，RLF可抑制体重增长和降低血脂水平;关颖等〔14〕研究表明，RLF可减轻心肌缺血-再灌注损伤。据此推测，RLF具有保护心肌细胞的功能，而本室先前的研究结果也表明〔1〕，RLF大剂量长期应用，可明显升高 CHF大鼠 LVSP、+dp/dtm，降低HR、LVEDP和CI，显著改善CHF大鼠的心脏功能。但RLF影响心功能的具体机制，尚未见报道。本实验研究发现RLF对CHF的治疗作用具有剂量依赖性，只有大剂量给药才能起到干预CHF的效果。另外，RLF大剂量组大鼠心肌CaM mRNA的表达下降，意味着心肌CaM的含量相对减少，而CaM的减少可以使Ca2+/CaM结合减少，通过减少对蛋白激酶C的活化，进而抑制Na+-Ca2+交换，减少Ca2+内流，减轻心肌细胞内钙超载，在一定程度上恢复钙稳态，从而改善心衰大鼠的心功能。

综上所述，RLF可以改善心功能，干预心衰，该保护作用可能与抑制心肌细胞内CaM mRNA的表达有关。由此推测RLF可能对CHF有一定的防治作用，而这一研究结果为发现RLF防治CHF的分子生物学机制，进一步开发RLF这一经济、有效、低毒的抗心衰中药提供了重要的理论依据。

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2 许莉莉，康 白，韩慧蓉，等.丝瓜络对慢性充血性心衰模型大鼠利尿作用及机制的研究〔J〕.山东中医杂志，2011;29(11):778-9.

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13 李 菁，付咏梅，朱伟杰，等.丝瓜络对实验性高血脂大鼠的降血脂效应〔J〕.中国病理生理杂志，2004;20(7):1264-6.

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