沙棘叶水提物对小鼠非特异免疫功能的影响及抗凝血作用

屈长青 丁计银 王新鲁 姬云涛 (阜阳师范学院生命科学学院，安徽 阜阳 23604)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)为胡颓子科酸刺属的落叶灌木、乔木或小乔木。别名黑刺、醋柳、酸刺。沙棘富含多种生物活性物质，具有多种药理功能〔1〕。沙棘黄酮是沙棘中一种重要的有效成分，沙棘叶和种子中总黄酮的含量高于果实，而且黄酮在降低血清胆固醇、抗肿瘤、抗溃疡、抗衰老、抗辐射、抗炎、抗病毒、抗心肌缺血、抗心衰、抗心率失常等方面有明显药理功效〔2，3〕。沙棘黄酮在治疗和缓解人类的某些疾病，如高血糖、高脂血症、心力衰竭及抑制血小板凝聚等方面具有明显的作用〔4～6〕。本实验旨在研究沙棘叶水提物对机体非特异性免疫功能和抗凝血作用的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 沙棘叶，新疆清河县隆豪发展有限公司提供;鸡血(菜市场新鲜鸡血);0.1%蛋白胨溶液;肝素钠;白细胞稀释液(冰醋酸1.5 ml、1%龙胆紫1 ml、加蒸馏水至100 ml);瑞氏染液;阿氏液(葡萄糖 2.05 g、枸橼酸钠0.8 g、柠檬酸0.055 g、氯化钠0.42 g、加蒸馏水至100 ml，加热溶解后将pH值调到6.1，经69 kPa、15 min的高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存备用。)

1.2 动物及仪器 健康昆明种小白鼠8只，体质量18～22 g，由胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室提供。电子天平(上海精密科学有限公司);XMTD-8222烘箱(上海精宏实验设备有限公司);LEICA DM1000正置荧光显微镜。

1.3 方法

1.3.1 沙棘叶水提物的制备 取沙棘叶叶15 g，加入蒸馏水至600 ml，浸泡 1 h，煎煮 50 min，过滤，残渣再加水，煎煮30 min，过滤，合并两次滤液，浓缩为500 mg/ml，4℃保存。用500 mg/ml沙棘叶水提物浓液配制成低、中、高剂量即10、20、30 mg/ml的溶液。

1.3.2 小鼠的分组和给药 小鼠分4组每组6只，分别按高、中和低剂量灌胃，对照组给予生理盐水，连续给药10 d。

1.3.3 断尾法测量小鼠的出血时间 末次给药1 h后，固定小鼠，在距离尾端1.5 mm处将其剪断，待血液流出时开始计时，并每隔30 s用吸水纸吸取血液一次，直至用吸水纸吸取时没有血液为止，此段时间即为小鼠的出血时间。

1.3.4 玻片法测量小鼠凝血时间 末次给药1 h后，在距离小鼠尾端5 mm处断尾，在断尾前尽可能地按摩小鼠尾部，从尾端到尾根，取干净的玻片，分别在玻片的两端滴一滴小鼠血液，自血液流出后开始计时，随后每隔30 s用针头挑拨血液，至能够挑出纤维状蛋白时停下，此段时间即为小鼠的凝血时间〔7，8〕。

1.3.5 小鼠白细胞数的测量 末次给药2 h后，在尾部取血20 μl，置于 380 μl的白细胞稀释液中，混匀后计数。

1.3.6 脾指数和胸腺指数测定 实验前称量小鼠体重，之后在做腹腔巨噬细胞吞噬试验的同时，剖取小鼠的脾和胸腺，用滤纸吸干残血后，称鲜重，计算脾指数和胸腺指数。

1.3.7 腹腔巨噬细胞的吞噬指数 实验前3 d，每天向小鼠腹腔注射1%的蛋白胨溶液，末次注射24 h后，再向小鼠腹腔注射1%的鸡红血细胞悬液1 ml，随即轻轻按摩小鼠腹部，30 min后，颈椎脱臼处死小鼠，取其腹腔液做成涂片，稍干后，用瑞氏染液浓染2 min，加入等量蒸馏水淡染13 min，水洗后镜检观察记录。根据倒置显微镜观察，按文献〔9〕，计算吞噬百分率与吞噬指数。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 沙棘叶水提物对小鼠断尾出血时间的影响 与对照组出血时间〔(2 640±268.328)s〕相比，不同剂量的沙棘叶水提物具有明显的抗凝血作用，高剂量与中、低剂量差异显著〔(52.30±177.482)、(4 512 ±269.665)、(4 308 ±79.145)s，P ＜0.01〕。

2.2 沙棘叶水提物对小鼠凝血时间的影响 连续给药10 d后，沙棘叶水提物能明显延长小鼠血液的凝血时间，高、中、低剂量组与对照组相比差异显著〔(1 139.8±25.675)、(923.2±18.185)、(787.2 ±12.872)、(697.0 ±21.926)s，P ＜0.05〕。

2.3 沙棘叶水提物对小鼠白细胞数量的影响 与对照组小鼠白细胞数量〔(555.4±299.078)个/ml〕相比，高、中、低剂量沙棘叶水提物组小鼠体内白细胞数目明显增多〔(7 869.0±173.940)、(10 045.0 ±880.057)、(6 012.6 ±205.946)个/ml，P＜0.05〕，中剂量组与高、低剂量组比较差异显著。

2.4 沙棘叶水提物对小鼠脾指数和胸腺指数的影响 高、中剂量组小鼠脾指数明显增高，中剂量组小鼠胸腺指数显著增高(P ＜0.05，P ＜0.01)。见表1。

2.5 沙棘叶水提物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数的影响 与对照组相比，实验组都能明显提高小鼠的巨噬细胞功能，中剂量组与高、低剂量组差异显著(P＜0.05，P＜0.01)。见表2。

表1 沙棘叶水提物对小鼠脾指数和胸腺指数的影响(s，n=6，mg/g)

表1 沙棘叶水提物对小鼠脾指数和胸腺指数的影响(s，n=6，mg/g)

与对照组比较:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，下表同

组别 脾指数 胸腺指数对照组2.304±0.030 5 2.964±0.093 2.204±0.028 2低剂量 3.052±0.087 2.300±0.031 6中剂量 3.390±0.0432) 2.520±0.033 91)高剂量 3.170±0.0372)

表2 沙棘叶水提物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数的影响(s，n=6，%)

表2 沙棘叶水提物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数的影响(s，n=6，%)

组别 吞噬率 吞噬指数对照组42.0±4.123 55.6±5.079低剂量 50.2±3.1151) 63.2±3.3471)中剂量 56.6±2.9662) 75.4±6.0952)高剂量 51.8±3.342) 65.2±4.1482)

3 讨论

细胞免疫是机体抵抗细胞内微生物(如病毒)和宿主细胞内增生的细菌感染的防御机制。白细胞数量、脾指数和胸腺指数可作为判断身体免疫功能强弱的指标。本实验表明，不同剂量的沙棘叶水提物和对照组比较能够明显增加白细胞的数目，中剂量效果显著;同时也对小鼠脾脏和胸腺有明显的增重效果，中剂量组脾、胸腺增重较多，指数较大。这与钟飞等〔10〕给小鼠腹腔注射沙棘总黄酮，能明显提高小鼠的胸腺指数和脾指数的结果一致。

腹腔巨噬细胞具有高度的吞噬能力，担负机体非特异性免疫的防御机能，具有参与调节免疫应答的功能。巨噬细胞的吞噬实验被用作衡量机体免疫功能的一项重要指标。韩春卉等〔11〕发现，沙棘油可明显增强小鼠NK细胞活性、提高小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能。本实验证明不同剂量组的沙棘叶水提物也可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。在抗凝血方面，本实验也证明沙棘叶水提物有延长小鼠的出血时间，抑制体内外血栓的形成，可显著降低小白鼠血小板黏附率，起到抗凝血的功效。

沙棘叶和种子中总黄酮的含量高于果实，黄酮在降低血清胆固醇、抗肿瘤、抗溃疡、抗衰老、抗辐射、抗炎、等方面有明显药理功效。本实验进一步研究了沙棘叶水提物对机体非特异性免疫功能和抗凝血作用的影响，为沙棘叶的药用价值和食用价值提供了实验依据，但其机制有待于深入研究。

1 廉永善.沙棘属植物天然产物及其主要生理药理功能〔J〕.沙棘，2005;18(3):5-16.

2 刘凤云.沙棘总黄酮的药理研究概况〔J〕.中药材，2004;27(2):145-7.

3 黄 浩，赵 鑫，姜 标.胡颓子科植物化学成分研究概况〔J〕.中草药，2006;37(2):307-9.

4 于 云，曲树明，何跃生.沙棘叶提取物的调血脂作用〔J〕.中草药，2002;33(9):824-5.

5 王正荣，王 玲，尹华虎，等.沙棘总黄酮对牵张所致心衰心肌细胞的收缩力学和钙离子转运的影响(英文)〔J〕.航天医学与医学工程，2000;13(1):6-9.

6 顾清萍.沙棘药用价值的开发和利用〔J〕.国际沙棘研究与开发，2003;1(2):28-31.

7 李欣燕，韩国柱，张书文，等.乌苏里藜芦碱对血小板聚集及凝血与出血时间的影响〔J〕.中草药，2004;35(11):1269-72.

8 邓伟峰，赵伟杰，吕 莉，等.乌苏瑞宁对家兔血液流变学和血凝时间及小鼠出血和凝血时间的影响〔J〕.中草药，2009;40(7):1115-7.

9 柏慧敏，张春燕，于文会.沙棘对大鼠非特异性免疫功能的影响〔J〕.中兽医医药杂志，2009;2:51-3.

10 钟 飞，蒋 韵，吴芬芬，等.沙棘总黄酮对小鼠细胞免疫功能的影响〔J〕.中草药，1989;20(3):46.

11 韩春卉，李燕俊，张 靖，等.沙棘油抗肿瘤作用及对小鼠NK和单核-巨噬细胞活性的影响〔J〕.中国热带医学，2010;10(5):571-2.