不同途径给予Neuritin对大鼠骨折愈合的影响＊

刘京敏，董金波，王维山，孙益明，彭方亮，张 杰

（石河子大学医学院第一附属医院骨一科，新疆石河子832000）

Neuritin是以色列科学家Nedivi发现的可促进神经突起的快速生长的一种神经营养因子。近年通过对Neuritin的不断研究发现，Neuritin可以稳定树突棘上突触的活性，促进突触成熟［1］，并且Neuritin是神经活动和神经营养因子发挥作用的共同下游因子，与神经可塑性密切相关［2－3］。另外，Neuritin还能促进真皮微血管内皮细胞增殖和聚集形成［4］，且作为一种新型血管生长因子在机体中起作用［5］。另有研究显示，除了神经系统，Neuritin在肝、心、肺、骨骼肌［6－7］等其他多个正常组织器官都有表达。作者前期动物实验研究发现，在脑外伤合并骨折模型中，其血清中Neuritin的含量较健康大鼠及单纯骨折的大鼠明显升高［8］。本研究通过口服及局部注射两种途径来探讨Neuritin对骨折愈合的影响，这将有助于设计新型药物干预手段或新的治疗途径加速骨折愈合，从而对临床骨折治疗提供重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料 实验于石河子大学医学院第一附属医院动物实验室完成，采用健康成年雄性SD大鼠90只，体质量（275±25）g，由新疆动物实验中心提供。Neuritin重组蛋白购自美国Sigma公司（生产批号：ab69775）。柯达DR3000摄片机（日本柯达公司）；佳能A80数码照相机（日本佳能公司）；Leica2135型石蜡切片机 （德国莱卡公司）；电钻、直径1mm克氏针（石河子大学医学院第一附属医院提供）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠股骨骨折模型建立及实验方法 将SD大鼠用浓度为100g／L的水合氯醛按照体质量（300mg／kg）进行腹腔注射麻醉，无菌条件下取右侧股骨外侧切口，纵行切开约2cm，显露股骨中断，截断后选择直径为1mm克氏针髓腔逆行固定，术后应用青霉素钠肌注，连续7d，分笼喂养允许自由活动。Ⅰ组不做特殊处理，Ⅱ组于术后第3天开始用灌胃管向大鼠胃中注入含0.025μL／L Neuritin的生理盐水0.3mL，每日1次，连续灌胃7d；Ⅲ组于术后第3天开始，在大鼠骨折断端局部注射含0.025μL／L Neuritin的生理盐水0.3mL，每日1次，连续注射7d；各组分别于术后1、2、3周分期采用颈椎脱臼法处死8只大鼠，并于骨折部位取材。

1.2.2 大体观察 于预计的时间点麻醉良好后，行X线拍片观察骨折愈合影像学观察。在处死后取出骨折断端的骨痂标本，肉眼观察其大体骨痂生长情况和骨折愈合情况，以骨痂Nordsletten X线评分标准评分。

1.2.3 骨痂体积测量［9］在剔除骨痂周围组织后，采用Perkins骨痂体积测量公式：2πR1（R2－R1）L测量各组骨痂体积，其中R1表示股骨半径，R2表示骨痂半径，L表示骨痂长度。

1.2.4 骨痂病理学检测（HE染色） 保留骨痂两侧各约1cm骨组织截骨，常温下4%的多聚甲醛固定48h后，再用蒸馏水浸泡4h，最后经EDTA－2Na（乙二胺四乙酸二钠）脱钙4～6周。常规脱水石蜡包埋、切片。光镜下观察新生骨小梁、软骨细胞、成骨细胞和骨重塑等细胞组织学形态变化。以骨痂组织学评分方法评分。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组内数据采用方差分析，组间比较采用t检验，计数资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大体标本观察及骨痂体积测量 1周时Ⅰ组骨折断端明显可分离，Ⅱ、Ⅲ组骨折两端可见局部的血肿机化组织，各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。2周时Ⅰ组断端机化组织明显增多，但是局部未见骨痂组织；Ⅲ组骨痂触之质韧，有弹性，可见纤维骨痂完整连接。3周时Ⅰ组局部出现略小的梭型骨痂，部分纤维骨痂未完整连接；Ⅲ组骨痂触之质硬，有骨性骨痂的连接，部分已经骨化；Ⅱ组骨痂膨隆较前明显增大，部分骨痂已经出现骨性愈合。骨痂体积测量显示，Ⅱ、Ⅲ组明显大于Ⅰ组（P＜0.05），Ⅲ组明显大于Ⅱ组（P＜0.05），见表1。

图1 骨折断端的X线片观察

图2 3组大鼠骨痂骨组织（HE染色×40）

2.2 X线摄片观察 1周时Ⅱ、Ⅲ组断端可见少量骨痂形成；2周时Ⅰ组骨折线仍然清楚，骨折断端未见明显的骨痂形成。Ⅱ、Ⅲ组骨折线开始模糊，部分骨痂包绕在骨折断端，但Ⅲ组的骨痂量要多于Ⅱ组（P＜0.05）；3周时Ⅰ组骨折线开始模糊，有少量骨痂形成，Ⅲ组周围见大量骨痂包围，甚至部分已经骨化，而Ⅱ组骨折线消失，骨折周围亦可见明显骨性骨痂形成；2、3周Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅰ组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅱ组与Ⅲ组间比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），见表2～3、图1。

表1 不同时间各组骨痂体积测量值结果（±s，mm3）

表1 不同时间各组骨痂体积测量值结果（±s，mm3）

▲：P＜0.05，与Ⅲ组比较；◆：P＜0.05，与Ⅱ组比较；▼：P＜0.05，与Ⅰ组比较。

病程组别 n 7d 14d 21dⅠ组 30 2.06±0.05▲ 10.04±0.11◆▲ 89.94±1.01◆▲Ⅱ组 30 2.70±0.22 38.55±1.50▲▼ 130.73±1.15▲▼Ⅲ组 30 3.79±0.34 56.41±3.31◆▼ 166.93±3.64◆▼

表2 骨折后2周各组X线片评分结果（n＝10）

2.3 HE染色结果 1周时Ⅰ组镜下可见骨折端内开始出现肉芽组织，新生毛细血管内皮细胞、纤维母细胞等，其间夹杂有个别的软骨细胞，成骨细胞及新生骨组织极少；Ⅱ、Ⅲ组肉芽组织、新生毛细血管、纤维母细胞逐步转化为肥大的软骨细胞，较Ⅰ组增多（P＜0.05）。2周时Ⅰ组镜下可见骨折端肉芽组织继续生长，少量纤维性骨痂生成；Ⅱ、Ⅲ组骨折断端软骨性骨痂增多，Ⅲ组骨折断端局部甚至出现编织骨痂，新生骨小梁长入。3周时Ⅰ组骨折端有大量软骨细胞，Ⅱ组可见大量骨性成分及新生骨小梁，Ⅲ组骨折处内外骨痂改造、塑建完善，甚至部分模型的骨髓腔已经形成；通过软骨细胞观察到骨折愈合情况，经秩和检验2、3周Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅰ组比较差异有统计学（P＜0.05）；Ⅱ组与Ⅲ组之间比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），见表4～5、图2。

表3 骨折后3周各组X线片评分结果（n＝10）

表4 骨折后2周各组软骨细胞评分结果（n＝10）

表5 骨折后3周各组软骨细胞评分结果（n＝10）

3 讨 论

3.1 神经因素与骨折愈合 骨折不愈合为临床一种常见的并发症，以往认为骨不连的发生和多种因素有关，研究发现骨不连的骨组织中少有或没有神经纤维长入，提示缺乏神经控制对骨折后产生骨不连或延迟愈合等不良预后有一定影响。而在骨折修复愈合过程中，局部骨生长因子或细胞因子起重要作用［10－11］，包括有骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生因子（PDGF）、成纤维生长因子（FGF）、转化生长因子－β（TGF－β）、神经生长因子（NGF）等。贝朝涌等［12］在动物实验中发现，NGF有促进骨折愈合的作用，并具有协同BMP－2诱导成骨的作用。但是有关神经因素影响骨折愈合的具体机制目前还不明确，因此，如何在分子水平通过神经因素的调节来治疗骨不连及延迟愈合将是下一步临床研究的重点和方向。

3.2 Neuritin与骨折愈合 作者在前期实验中已证实，在脑外伤合并骨折的大鼠模型，其血清中Neuritin含量明显升高，且局部注射Neuritin可明显加速骨折愈合［7］。而且魏勇等［13］研究发现，脑外伤合并骨折患者血清中NGF、Neuritin表达明显高于对照组，说明与骨折有密切的相关性，两种因子可能在骨折愈合中共同起作用。本实验研究采用Neuritin对SD大鼠骨折模型进行口服及局部注射，观察骨折愈合情况。X线片评分结果显示，术后2周时对照组与口服组、局部注射组差异有统计学意义（P＜0.05）；术后3周时，差异更加明显。这表明无论是口服还是局部注射Neuritin，大鼠骨折愈合速度均明显加快；口服组与局部注射组之间比较，后者变化更加显著，前者次之，这表明局部注射Neuritin在加速新生骨痂形成和成熟方面效果较口服更加显著。组织学观察结果显示，口服组与局部注射组术后1～3周，软骨细胞明显增多，软骨化骨的比率逐渐增高，并可见较成熟的小梁状骨，而且在同一时间点上，口服组与局部注射组均比对照组变化明显（P＜0.05），而前两者比较，局部注射组变化又较口服组显著（P＜0.05），这表明局部注射组在促进骨痂形成、成熟及加速骨折愈合方面明显优于其他组。作者认为，这可能是由于：（1）Neuritin注射于大鼠骨折断端，局部药物浓度高，从而对周围神经、血管及骨组织直接发挥作用；（2）口服Neuritin，在胃内被消化分解一部分，最终经吸收进入血液循环，到达骨折部位，这期间必然会影响其有效浓度，从而促进骨折愈合的作用也会较局部注射组减弱；（3）一般来说，药物的生物利用度的关系为“肌肉＞皮下＞口服”，也支持上述结论。

3.3 Neuritin促进骨折愈合的可能机制 对骨折愈合中神经营养因子（neurotrophins，NTFs）表达的研究表明，骨痂中有多种NTFs表达，包括脑源性神经营养因子（BDNF），NGF和神经营养因子3，骨形成细胞有NGFs受体trkA和trkC的表达，提示NTFs涉及骨形成的调节。Neuritin作为神经营养因子家族的一个新的成员，其可能是通过以下途径促进骨折愈合的：（1）Neuritin促进神经再生。研究显示，Neuritin可以稳定树突棘上突触的活性，促进突触成熟［1］，对其蛋白的初步功能研究提示，重组体Neuritin促进神经突起的生长和分支［14］，而无论是神经活动的刺激还是神经生长因子的直接作用都能诱导神经突起的生长，提示Neuritin是神经活动和各种神经生长因子的共同下游因子，可促进神经细胞树突和轴突的生长和分支，在神经再生和可塑性中起着重要作用，而神经纤维的长入影响骨折愈合修复过程。（2）Neuritin与其他因子的协同作用。最近的研究显示，Neuritin是NGF介导的神经突起生长过程中必不可少的因子［2］，并与 NGF具有协同作用［15］，而大量实验已证实，局部应用NGF可明显促进骨折愈合。提示Neuritin可能与其他神经营养因子通过协同作用促进骨折愈合。（3）Neuritin与血管再生。在周围神经再生过程中，血供非常重要，它会影响神经内微环境的恒定，影响许旺细胞的增殖，从而影响轴索再生和髓鞘的再形成。外周组织中血管和神经发育模式通常是协调一致的。Neuritin调节细胞结构的功能同样适用在非神经元细胞，且作为一种新型血管生长因子在机体中起作用［5］。Neuritin还可促进血管生长，增强血管内皮细胞的粘附和迁移能力，有利于新生的毛细血管的生长，改善骨折断端的血流动力学，促进骨折的修复愈合。

综上所述，Neuritin可加速骨折愈合，神经因素对骨折愈合的调节作用是肯定的，然而，目前有关Neuritin在体内的含量、分布还缺乏实验证据，并且关于Neuritin与骨折愈合的相关报道甚少，因此在选择Neuritin剂量的时候也没有明确的标准，导致本实验，在选择Neuritin的浓度时有一定局限性，尚未确定促进大鼠骨折愈合的最佳治疗浓度，本研究通过SD大鼠动物实验，意在初步验证Neuritin对骨折愈合的作用，以及探讨不同途径给予Neuritin对骨折愈合疗效的对比，为临床用药提供基础理论依据。

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