Ras／Raf／MEK／ERK信号传导通路在2型糖尿病大鼠局灶性脑缺血早期作用的研究＊

王文娟，武晓宁，贾玉洁，谷 成，闵连秋△

（1.辽宁医学院研究生学院，辽宁锦州 121000；2.辽宁医学院附属第一医院神经内科，辽宁锦州 121001）

近些年来，糖尿病合并脑梗死的发病率逐年升高，给人们的健康带来了严重的威胁。糖尿病已经被认为是脑梗死的独立危险因素，能加重神经细胞的凋亡，增加了脑梗死的致残率和病死率，严重地影响了患者预后的生活质量。有关糖尿病加重脑梗死的机制近年来研究较多，但具体机制至今尚未明确［1］。本实验旨在探讨大鼠局灶性脑缺血早期Ras／Raf／丝裂原激活蛋白激酶（mitogenactivatedp rotein kinase kinase，MEK）／细胞外信号调节激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）信号传导通路的作用，以及糖尿病加重脑梗死与Ras／Raf／MEK／ERK传导通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选取健康的雄性SD大鼠，体质量280～330g，由辽宁医学院动物实验中心提供，合格证号［SCXK（辽）2003－0007］。PD98059 由 德 国 默 克 公 司 提 供 （批 号 51300I）；p－ERK1／2一抗、二抗均由北京博奥森生物有限公司提供，末端脱氧核苷酸转移酶接到的dUTP原位切口末端标记（TUNEL）试剂盒购于南京凯基公司。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿病（T2DM）大鼠脑缺血模型的建立 取SD大鼠常规饲料适应性饲养1周，然后喂饲高脂高糖饲料（10%猪油，2.5%胆固醇，1.0%猪胆酸盐，20.0%糖，66.5%常规饲料［2］）。4周后，按25.0mg／kg［3］体质量的剂量一次性尾静脉注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液。72h后取尾血测血糖，血糖超过16.7mg／kg为T2DM大鼠［4］。选取T2DM造模成功的SD大鼠，按照文献［5］制作大鼠大脑中动脉缺血模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。麻醉后的SD大鼠颈部正中切口，暴露并钝性游离左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA），结扎同侧CCA近心端和颈外动脉（external carotid artery，ECA）分叉部，距CCA末端约5mm处剪口，选用头端烧成光滑杵状的国产尼龙线（直径0.235mm，长6 cm）插入，以颈总动脉分叉处计算进线深度为（18.0±0.5）mm，至大脑中动脉起始部以完全阻断血供。假手术组手术步骤同上，但不插入线栓。

1.2.2 分组与给药 将大鼠分为假手术组、健康大鼠脑缺血组、T2DM大鼠脑缺血组、PD98059组，每组12只。假手术组是选取健康大鼠只游离出动脉不进行栓塞；健康大鼠脑缺血组是选取血糖正常，进行MCAO造模成功的大鼠；T2DM脑缺血组为选取糖尿病造模成功且MCAO造模成功大鼠；PD98059组为选取糖尿病造模成功且MCAO造模成功大鼠，此组大鼠于 MCAO术前30min尾静脉注射 PD98059（3mL／kg）。MCAO术2h后各组取6只大鼠麻醉、处死、灌流、石蜡包埋固定制成病理切片；每组剩余的6只大鼠迅速取缺血侧大脑海马，保存于－80℃冰箱。

1.2.3 评价标准 参照Bederson 6级5分评分标准，对大鼠MCAO术后2h进行3次神经功能评分，平均值大于或等于2分提示造模成功，评分标准见表1。

表1 Bederson评分标准

1.2.4 检测方法

1.2.4.1 TUNEL法检测大鼠脑组织神经细胞凋亡 切片常规脱蜡水化，3%H2O2室温处理后蛋白酶K于37℃消化10 min，标记液32℃标记2h，后封闭30min，生物素化地高辛抗体37℃反应37min。加SABC、DAB显色，常规封片。在海马CA3区不重复随机选取5个高倍视野，在400倍光镜下计算阳性细胞（阳性细胞数／计数细胞总数）100% 。

1.2.4.2 免疫组化法检测大鼠脑组织p－ERK1／2的表达 采用SABC法按照免疫组化试剂盒说明进行。显微镜下观察缺血侧大脑海马CA3区p－ERK1／2表达情况，每张免疫组化切片中采集5个具有代表性的高倍视野，在400倍光镜下计数海马CA3区p－ERK1／2的阳性细胞数。

1.2.4.3 蛋白质印迹法（Western blotting）检测大鼠脑组织p－ERK1／2的表达 将冻存的脑组织剪碎置于裂解液中机械匀浆，4℃17 000r／min离心1h，取出上清液。用考马斯亮蓝G250结合法，根据已知牛血清清蛋白溶液的浓度及其吸光度和样品吸光度计算样品蛋白浓度和加样量。加入样品缓冲液，置于沸水浴中5min使蛋白变性。制备7.5%分离胶和4%浓缩胶，将样品加在凝胶表面的样品槽中，电泳后转移至硝酸纤维素膜上。5%奶粉TTBS缓冲液振荡封闭3h后洗膜，分别加入一抗、β－actin，4℃冰箱孵育1夜。洗膜，辣根酶标记，室温孵育1h，洗膜后进行增强化学发光（enhanced chemilum inescence，ECL）反应1～3min，暗室曝光，显影后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像分析测定目标带的光密度（integrated density value，DV），计算出各指标各组目标带与β－actin DV比值。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示。组间显著性检验采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠神经行为学评分 T2DM大鼠脑缺血组较健康大鼠脑缺血组神经行为学评分明显增高，而PD98059组神经行为学评分明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 大鼠神经行为学评分

2.2 免疫组织化学测定大鼠缺血侧大脑海马CA3区p－ERK1／2蛋白的表达 p－ERK1／2阳性染色呈深棕色，常存在于神经元胞浆中，磷酸化后转移至细胞核。阳性染色的神经细胞核呈深棕色，多数发生形态学改变，胞核皱缩，核仁偏位或者缺失。假手术组偶见p－ERK1／2阳性蛋白表达。健康大鼠脑缺血组可见p－ERK1／2阳性神经细胞核，T2DM大鼠脑缺血组阳性胞核增多，PD98059组阳性胞核明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），见表3、图1。

2.3 Western blotting测定大鼠缺血侧海马p－ERK1／2蛋白

p－ERK1／2蛋白在假手术组表达较少，在健康大鼠脑缺血组和T2DM大鼠脑缺血组表达较多，且T2DM大鼠脑缺血组增高明显P＜0.01，而p－ERK1／2蛋白在PD98059组表达明显减少，见表4、图2。

2.4 TUNEL法检测大鼠缺血侧大脑海马CA3区神经细胞凋亡情况 凋亡的神经细胞核为棕黄色颗粒。假手术组海马CA3区偶见神经细胞凋亡，健康大鼠脑缺血组缺血侧海马CA3区见较多神经细胞凋亡，T2DM大鼠脑缺血组凋亡率较健康大鼠脑缺血组明显升高（P＜0.01），而PD98059组凋亡率明显下降，见表5。

表3 免疫组织化学测定大鼠缺血侧大脑海马CA3区p－ERK1／2阳性细胞数

图1 免疫组织化学测定大鼠缺血侧大脑海马CA3区p－ERK1／2阳性表达（×400）

表4 Western－blotting法检测大鼠缺血侧海马p－ERK1／2蛋白灰度比值（±s）

表4 Western－blotting法检测大鼠缺血侧海马p－ERK1／2蛋白灰度比值（±s）

＊：P＜0.01，与假手术组比较；＃：P＜0.01，与健康大鼠脑缺血比较。

组别 n 6 0.003 2±0.000 1健康大鼠脑缺血组 6 0.012 4±0.000 2＊T2DM大鼠脑缺血组 6 0.038 4±0.001 7＊＃PD98059组 6 0.007 4±0.000 1＊＃灰度比值假手术组

图2 Western blotting法检测大鼠缺血侧海马p－ERK1／2蛋白的表达

表5 大鼠缺血侧大脑海马CA3区神经细胞凋亡率

3 讨 论

脑缺血后神经细胞的凋亡是一个动态进行的过程，在早期（30min时）缺血区会出现明显的水肿，水肿区的周围出现少量的凋亡细胞，随着缺血时间的延长神经细胞的凋亡数目增加，凋亡的神经细胞主要位于缺血半暗带区，而缺血中心区细胞的死亡以坏死为主［6］，因此选取大鼠海马CA3区作为观察区域。本实验主要研究大鼠脑缺血早期神经细胞的凋亡情况及与Ras／Raf／MEK／ERK信号传导通路的关系，所以选取MCAO术后2h作为观察的时间点。

Ras／Raf／MEK／ERK信号传导通路是一条可以被多种因素广泛激活的有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）通路。MAPK通路的核心包括3种蛋白激酶：（1）MAPKKK，是一类丝／苏氨酸蛋白激酶，Raf为其中重要的一员；（2）MAPKK，具有磷酸化苏／酪氨酸残基的双特异功能，Mek为其中重要的一员；（3）MAPK是一类丝／苏氨酸蛋白激酶，Erk即为其中重要的一员［7］。是当Ras受到细胞外信号刺激时，即转化为激活型Ras，激活型Ras继而激活Raf－1；而Raf－1可将 MEK磷酸化激活，p－MEK进一步磷酸化ERK1／2，然后p－ERK1／2再将细胞核内的 ElK－1L磷酸化，此瀑布式的激活过程将神经细胞外的信号通过细胞膜、细胞质传递到细胞核，来调节细胞周期调控细胞的增殖、分化和凋亡等生理病理过程［8］。PD98059是ERK的上游激酶 MEK－1特异性阻断剂，能够阻断Ras／Raf／MEK／ERK信号通路的传导，从而影响了细胞的命运。本实验采用TUNEL染色法，对比观察高血糖、高血脂大鼠和健康大鼠MCAO术后2h海马CA3区神经细胞凋亡变化，并通过免疫组织化学、Western blotting，对比观察高血糖、高血脂大鼠和健康大鼠p－ERK1／2蛋白表达变化，以明确Ras／Raf／MEK／ERK信号传导通路是否参与了T2DM加重脑缺血损伤时的神经细胞凋亡，从而进一步明确高血糖、高血脂加重脑缺血损伤的机制。从实验结果看，与健康大鼠脑缺血组相比，T2DM大鼠脑缺血组的p－ERK1／2蛋白表达明显增加（P＜0.01），免疫组织化学与 Western blotting结果一致。TUNEL结果显示，健康大鼠脑缺血组有部分神经细胞凋亡，而T2DM大鼠脑缺血组凋亡率明显升高（P＜0.01），可见高血糖、高血脂能引起P－ERK1／2蛋白上调从而加重了神经细胞的凋亡。

可以推论 Ras／Raf／MEK／ERK信号传导通路可能是T2DM加重缺血性脑损伤机制中的一条重要的信号传导通路。但从实验结果看，阻断了Ras／Raf／MEK／ERK信号传导通路仅能部分抑制神经细胞的凋亡，经PD98059干预的缺血组其神经细胞的凋亡率仍明显高于假手术组（P＜0.01），这与付度关［9］得出的结论一致，这又进一步说明了神经细胞凋亡机制的复杂性，需要更进一步的研究。

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［5］ 陈佳俊，石岩殊，韩雪梅，等.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型（PMCAO）的实验研究［J］.吉林医学，2004，25（10）：16－17.

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［9］ 付度关.ERK对缺血缺氧性脑损伤后神经细胞凋亡的影响［J］.卒中与神经疾病，2007，14（6）：346－349.