铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶及耐药性的研究

毕爱芬

近几年，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药逐年上升，给治疗带来巨大挑战[1]。由于铜绿假单胞菌产生金属β-内酰胺酶，而使得其对碳青霉烯类抗生素产生严重的耐药性，金属β-内酰胺酶可水解基本所有的β-内酰胺酶类抗生素，加之其耐药基因编码区在整合子内，使得耐药性能在菌株之间广泛传播[2]，而IMP与VIM是最常见的金属β-内酰胺酶的耐药基因，但金属β-内酰胺酶的携带率每个地区差异很大，因此，本研究收集本院2010-2012年的铜绿假单胞菌，并进行金属β-内酰胺酶与耐药基因检测，了解目前金属β-内酰胺酶的相关耐药以及在铜绿假单胞菌的携带率，以便为临床治疗提供有效的指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 实验菌株由广州市花都区中西医结合医院2009年10月-2012年6月住院及门诊患者标本中分离的铜绿假单胞菌共216株。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853与大肠埃希菌ATCC 25922，购自卫生部临床检验中心。

1.1.2 仪器与试剂 仪器为法国生物梅里埃公司的VITEK32全自动微生物鉴定及药敏系统，M-H琼脂为广州环凯生物有限公司，亚胺培南（IPM，10 μg/片）、头孢他啶（CAZ，30 μg/片）均购自英国OXl0D公司，EDTA（100raM，10 ul/片），PCR MIX来自广州东盛生物科技有限公司。引物由上海英骏生物有限公司合成。

1.1.3 引物序列见表1。

引物 序列 PCR产物大小 参考文献VIM-F GTTTGGTCGCATATCGCAAC 645bp [3]VIM-R CTACTCGGCGACTGAGCGAT IMP-F CGGCCKCAGGAGMGKCTTT 587bp [4]IMP-R AACCAGTTTTGCYTTACYAT Int1-F GGTGTGGCGGGCTTCGTG 457bp [5]Int1-R GCATCCTCGGTTTTCTGG SPM-F GCGTTTTGTTTGTTGCTC 786 bp [3]SPM-R TTGGGGATGTGAGACTAC GIM- F AGAACCTTGACCGAACGCAG 746 bp [3]GIM-R ACTCATGACTCCTCACGAGG

1.2 方法

1.2.1 金属β-内酰胺酶检测 采用双纸片协同法检测金属β-内酰胺酶，按照纸片扩散法标准操作[6]，以0.5麦氏调整菌液浓度后，接种于M-H琼脂平板上，贴上两张空白纸片，两者距离大于20 mm，分别加上3 μl的2-巯基乙醇原液与5 μl的EDTA（100 mmol/L），然后在距离20 mm处贴上亚胺培南（10 mg），头孢他啶（10 mg），经过夜35 ℃培养，若空白纸片与任何一个药敏纸片的抑菌环有扩大者，则显示该菌株产金属酶。

1.2.2 整合子检测 采用煮沸法提取细菌DNA[7]。在培养基上挑取2～3个菌落于400 μl的TE缓冲液里混匀，然后95 ℃10 min水浴，12 000 r/min离心10 min，取上清液作PCR模板，-20 ℃保存备用。按照产品说明配制PCR体系，PCR循环参数为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃ 5 min。取PCR产物电泳后，经凝胶成像系统分析。

1.2.3 耐药基因检测 细菌质粒DNA的提取采用SDS碱裂解法，按照产品说明配制PCR体系，PCR循环参数为：95 ℃4min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 循环 30 次；72 ℃8 min。

1.2.4 质控 每周按标准严格使用 质 控 菌铜绿假单胞菌ATCC 27853与大肠埃希菌ATCC 25922对实验进行质量控制。

2 结果

2.1 菌株基本情况 携带金属β-内酰胺酶的菌株共检测出80株，占37.03%（80/216），来源科室主要是ICU、内科及外科，分别是33例（41.25%），18例（22.5%），14例（17.5%），标本大部分来自患者痰，占61.25%（49/80），患者男54例，女26例，平均年龄77岁。

2.2 产金属β-内酰胺酶菌株 216株临床分离株通过双纸片协同法检出80株产金属β-内酰胺酶（MBL），其中78.75%（63/80）的MBL菌株都是多药耐药菌株，甚至有18.75%（15/80）是泛耐药株。药敏试验结果中，耐药性最高的前三位是氨曲南，环丙沙星和哌拉西林，耐药率都达77%以上，见表2。

表2 80株产金属β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌耐药情况

2.3 VIM与IMP基因检测结果 对80株MBL菌株进行IMP与VIM基因扩增，结果发现23株（28.75）携带IMP基因，9株（11.25%）被检测到有携带VIM基因，它们的长度分别是587bp与645bp。见图1、图2。其中9株携带VIM基因的菌株都对亚胺培南抗生素耐药，而87.5%的VIM与IMP基因阳性菌株都是多药耐药。

2.4 整合子检测结果 Ⅰ类整合子检出率却达MBL阳性菌株的82.5%（66/80），电泳图可见457bp大小目的片段，见图3。其中亚胺培南耐药菌株中Ⅰ类整合子阳性率占85.71%（48/56）。未检出SPM与GIM基因。

图1 IMP基因电泳图

图2 VIM基因电泳图

图3 Int1基因电泳图

3 讨论

近几年，产金属酶的铜绿假单胞菌备受临床关注，正由于金属酶能水解几乎所有的β-内酰胺酶类抗生素，甚至出现了超级细菌携带NDM-1基因金属酶，给临床治疗带来极大的挑战。本研究结果表明，产生金属酶的铜绿假单胞菌对各类抗生素耐药率高，达70%以上，根据中国CHINET的数据，铜绿假单胞菌对各种抗生素的耐药率一般都是30%左右[8-9]，而携带了金属酶大大提高了其耐药率，且出现多药耐药株甚至是泛耐药株。在住院患者中，大部分患者都是内科和ICU，占63.5%，国内外报道表明，ICU一直以来都比院内其他部门耐药率要高[10-11]。Lodise等[12]认为，由于ICU收治的患者多为重患者，患者免疫功能低下，诊疗过程中的各种侵袭性操作和大量广泛使用广谱抗菌素，致使入住ICU成为多药耐药株产生的危险因素。

检测金属酶的方法有许多，入PCR法、E-test法、三位试验、纸片增效法及纸片协同法，本文利用金属酶的特征：二价金属离子与EDTA等有机络合剂络合的关系，从而观察抑菌圈增大来判断细菌是否产生金属酶[13]。此方法操作简单，经济，快捷，非常适合临床筛选金属酶检测使用，本院分离的铜绿假单胞菌中金属β-内酰胺酶的携带水平较高，陈键[14]研究表明，铜绿假单胞菌金属酶的检出率是27.8%，而本研究达37.03%，国外铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶检出率相对较低[15]。由此看出，本院应加强对应金属β-内酰胺酶方法建立以及管理。

金属酶又分为先天型和获得型，铜绿假单胞菌大部分都是获得型金属酶，有五种类基因型VIM、IMP、SPM和GIM、SIM，其中最常见的是IMP和VIM。大多数获得性金属酶位于可移动的整合子中，少数通过可移动的共同区域（cR）进行转移[16]。本研究中IMP与VIM基因检出率分别为28.75%（23/80）与11.25%（9/80），其检出率与国内同期文献检出率基本一致，可见产金属酶的铜绿假单胞菌更容易导致IMP耐药。谢才文[4]与肖震等[17]研究报道，IMP检出率是14.7%（28/190），VIM检出率11.5%（12/104），而整合子检出率达金属酶菌株的82.5%（66/80），这也表明了大多数获得性金属酶都位于整合子中，使得菌株携带的耐药基因更容易在院内广泛传播，增加了院内感染耐药性菌株机会，此外，这次研究中亚胺培南耐药菌株中Ⅰ整合子阳性率占85.71%（48/56），Shinobu等[18]研究表明，金属酶在强启动子下表现高活性，从而引起亚胺培南耐药，这或许能推测出本研究中亚胺培南耐药与整合子的相关性由此引起。

由于本院感染的铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的检出率较高，且其耐药率较非产酶的铜绿假单胞菌明显增高，因此，在临床用药治疗时必须依据药敏试验结果选择敏感的抗生素成为治疗关键。院内应加强铜绿假单胞菌的金属β内酰胺酶的监测，同时了解其科室分布状况及药敏情况，分析耐药趋势，以便采取适当及时的有效措施控制铜绿假单胞菌院内感染广泛扩散，提高治疗成功的几率。

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