HPLC法测定人血浆中亚胺培南浓度及建立临床标本采样流程

蔡 婕 许金娜 倪穗琴

广州市第一人民医院临床药学科 (广州 510180)

亚胺培南(imipenem, IMP)是重症感染患者常用的碳青霉烯类抗菌药物，适用于多种病原体所致和需氧/厌氧菌引起的混合感染[1]。重症感染患者病情复杂，同时常合并多脏器功能衰竭、低蛋白血症以及脏器替代支持治疗(如连续肾替代治疗或体外膜肺氧合等)，从而导致患者出现水钠潴留、血流再分布等现象，药动学行为难以预测[2]，此时依旧按照经验用药可能导致患者血药浓度过高或不达标，继而出现不良反应或疗效不佳。

亚胺培南为时间依赖性抗菌药物，通常推荐日剂量分多次给药和(或)延长滴注时间来增加临床疗效，评价该类药物疗效的相关参数为游离抗菌药的%T>MIC，即%fT>MIC(血药浓度维持在最低抑菌浓度以上的时间)[3]。普通患者达到40%T>MIC可达到杀菌效果，多重耐药菌或重症感染时需达到100%T>MIC，甚至40%T>4～5×MIC[4]才能获得较佳疗效。因此，对重症患者进行治疗药物监测，有助于临床及时调整剂量，制定个体化给药方案[5]。

相比于其他抗菌药物，亚胺培南在血浆中不稳定，易受温度、pH值等影响[6-7]，因此，临床标本保存方式不当或未在规定的时间内送检，会造成测定结果不准确。本研究旨在建立HPLC法测定亚胺培南血药浓度，并考察在不同条件下的稳定性，以期建立规范的临床标本采样流程，为开展亚胺培南TDM提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 仪器与试药

高效液相色谱仪(HPLC 1260，美国Agilent公司)；电子分析天平(CPA225D，德国Sartorius公司)；离心机(H1650，湖南湘仪实验仪器)；涡旋仪(NP-30S，上海精科实业有限公司)；超声波清洗机(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)。

亚胺培南标准品(批号CS30026-F67081，纯度：92.5%，EP欧洲药品健康管理局)；乙腈，甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；3-(N-吗啉基)丙磺酸(3-morpholinopropanesulfonic acid,MOPS)(批号：M105135，含量：99.5%，上海阿拉丁公司)；乙酸铵、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 色谱条件

流动相：0.01 mol·L-1乙酸铵溶液(pH 6.8)：乙腈=95∶5；色谱柱：Agilent Zorbax SB-AQ(4.6 mm×250 mm，5 μm)；进样量：30 μL；流速：1.0 mL·L-1；柱温：30 ℃；紫外波长：298 nm。

1.3 溶液配置

1.3.1 稳定剂配制 将2.64 g MOPS粉末溶于100 mL超纯水中，再用1 mol·L-1NaOH调节pH值至6.8，混匀后过滤，4 ℃冷藏备用。

1.3.2 储备液配制 精密称取适量亚胺培南标准品于容量瓶中，加入MOPS制成约1 mg·mL-1储备液并分装，-20 ℃保存备用。

1.4 血浆样本处理

实验室收到患者血样后，将血样以3 000 r·min-1离心5 min，然后精密吸取血样与MOPS各100 μL(1∶1)，再加入乙腈300 μL，涡旋混匀，14 000 r·min-1离心5 min，取上清液进样。

1.5 方法学验证

1.5.1 专属性试验 在上述色谱条件下分别将空白血浆、空白血浆+亚胺培南和用药患者血浆进样，并将图谱进行比对，考察方法的专属性。

1.5.2 标准曲线和定量下限 用MOPS将亚胺培南储备液稀释为3.30、6.60、13.20、26.40、52.80、105.60 μg·mL-1的溶液，再加入等比例空白血浆，以浓度x为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归分析，定量下限为信噪比等于10。

1.5.3 准确度与精密度 亚胺培南储备液用MOPS稀释为0.41、0.83、52.80和70.40 μg·mL-1的溶液各5份，并加入等比例空白血浆，连续测定3批样品(分两天进行)，得出平均浓度测定值，计算方法的回收率、批间和批内相对标准偏差(relative standard deviation,RSD，分别考察方法的准确度和精密度。

1.5.4 稳定性试验

1.5.4.1 稳定性血浆 取亚胺培南储备液100 μL，加入MOPS配制为低、中、高3个浓度(0.83、52.80和70.40 μg·mL-1)，并加入等比例(100 μL)空白血浆，在-20 ℃、4 ℃和室温下分别放置2、4、6、12、18、24、48、72 h，在测定当天处理血样，考察加入MOPS中亚胺培南稳定性。

1.5.4.2 非稳定性血浆 取亚胺培南储备液100 μL，加入空白血浆配制为低、中、高3个浓度(0.83、52.80和70.40 μg·mL-1)，在-20 ℃、4 ℃和室温下分别放置2、4、6、12、18、24、48、72 h，在测定当天，加入等比例(100 μL)MOPS，考察在未加入MOPS下亚胺培南稳定性。

2 结 果

2.1 方法学评价

2.1.1 专属性 由图1可知，亚胺培南峰形良好，保留时间约为4.1 min，溶剂、血浆中内源物质等对其测定无干扰,见图1。

图1 HPLC法测定亚胺培南色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+亚胺培南；C.用药患者血浆

2.1.2 标准曲线和定量下限 亚胺培南在3.30～105.60 μg·mL-1内与峰面积呈良好线性关系，回归方程为y=11.34x+1.117(R2=0.999 1)，定量下限为0.41 μg·mL-1。

2.1.3 准确度与精密度 亚胺培南在四个浓度下(0.41、0.83、52.80和70.40 μg·mL-1)，批内回收率为(97.83±2.75)%～(103.54±3.98)%，RSD为2.81%～7.17%；批间回收率为(99.43±3.74)%～(104.24±4.48)%，RSD为3.76%～11.97%，批内和批间RSD均<15%，符合生物样本测定要求(见表1)。

表1 亚胺培南血药浓度测定方法的准确度和精密度

2.1.4 稳定性 在稳定性血浆中，亚胺培南在-20 ℃或4 ℃下，放置72 h保留比例分别为93.93%和91.93%，在室温放置18 h后，降解比例超过15%；在非稳定性血浆中，在-20 ℃和4 ℃放置24 h保留比例在90%以上，在室温放置6 h后，降解比例剧增，当放置12 h时，降解比例接近20%(见图2)。以上说明加入MOPS时，亚胺培南在低温条件下可稳定72 h，在室温可稳定18 h；未加入MOPS时，亚胺培南在低温下稳定24 h，室温稳定6 h。

图2 不同放置条件下亚胺培南的稳定性

2.2 亚胺培南临床标本采样流程建立

基于亚胺培南稳定性试验结果，制定临床标本采样流程(图3)。临床科室在采集患者血样后，务必在6 h内送检，若无法立即送检，则保存血样于4 ℃冰箱内，并在24 h内送检。实验室收到临床样本后，需立即进行处理(加入稳定剂并保存于冰箱内)，并在72 h检测完毕，以保证亚胺培南测定结果的准确性。

图3 亚胺培南临床标本采样流程

3 讨 论

亚胺培南结构中因C-N键自由旋转受阻，因此存在一对旋转异构体(顺式A和反式B)[8]，一般情况下，该异构体相互转化、动态平衡，但在测定血药浓度时需要抑制异构体的分离，避免出现宽峰或裂峰[9]。刘浩等[8]研究表明，温度、pH等对异构体分离有一定影响，柱温越低，异构体转化速率降低，峰形易展宽并出现裂分[10]；pH越低，异构体分离越大，因此在建立血药浓度方法时，需提高柱温并避免使用酸性流动相。同时，考虑到亚胺培南易受温度影响而降解，柱温不宜设置过高。综上，本方法将柱温设为30 ℃，且流动相选用中性溶液(乙酸铵缓冲液pH 6.8)。亚胺培南极性较强，摸索方法时缓冲液比例多在90%以上，为延长色谱柱寿命，本试验选用耐纯水的AQ色谱柱[11]。

由于亚胺培南稳定性较差，温度、pH值等对其稳定性均有影响[12-13]，宜用中性缓冲液储存[14]，本试验选择MOPS(pH 6.8)作为稳定剂[15-16]，并重点考察了不同温度下，亚胺培南在稳定性血浆(先加入MOPS)和非稳定性血浆(测定时再加入MOPS)的稳定性。结果显示，相同温度下，亚胺培南在稳定性血浆中保留比例均大于非稳定性血浆；低温条件下(-20 ℃或4 ℃)保留比例均大于室温，说明低温和加入稳定剂有助于提高亚胺培南的稳定性。在未加入稳定剂时，亚胺培南在低温条件下可保持24 h稳定，在室温时只能保持6 h稳定，提示血样采集后须立即送检(室温下不超过6 h)，若无法送检，应放置4 ℃不超过24 h；在稳定性血浆中，亚胺培南在-20 ℃和4 ℃保存72 h均可满足测定要求，因此，我科收到血样后需立即进行处理，并在72 h内检测完毕。

本研究建立的亚胺培南血药浓度测定方法简便、灵敏、重复性好，可广泛应用于临床。同时，基于稳定性试验结果建立临床标本采样流程，以规范临床送检时间和保证结果准确，为亚胺培南治疗药物监测提供科学依据。