荞麦糠皮提取物对2型糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用

勾向博，郭 静，王银环，艾凌艳，韩淑英

（1.河北联合大学基础医学院药理学教研室，河北 唐山 063000；2.河北联合大学实验研究中心，河北 唐山 063000；3.河北联合大学机能实验室，河北 唐山063000；4.河北联合大学理学院物理教研室，河北 唐山 063000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是胰岛素分泌绝对或相对不足导致的靶组织细胞对胰岛素的敏感性降低，从而导致糖、蛋白质和脂肪等一系列物质代谢紊乱，最终引起内分泌代谢紊乱的一类疾病。DM患者长期高血糖、高血脂可引起糖尿病心肌病，其发病机制主要与心肌能量代谢紊乱、心肌纤维化、氧化应激和高糖所致的心肌细胞凋亡等有关[1]。荞麦属于蓼科植物，荞麦的成分中生物类黄酮、手性肌醇、高活性蛋白和高活性膳食纤维等可以有效减轻DM症状[2]。据报道[4]：荞麦花叶总黄酮可以改善2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）大鼠胰岛素抵抗[3]，降低其血糖、血脂水平，对大鼠肾脏损伤也有保护作用[5]。荞麦糠皮是荞麦籽粒加工成米时的废料，目前有关荞麦糠皮的报道甚少，特别是在废料中提取有效成分研究其对T2DM大鼠心肌损伤的保护作用，目前尚未见报道。本实验以链脲佐菌素（STZ）诱导的T2DM大鼠为研究对象，使用荞麦糠皮提取物（extract from buckwheat chaff，EBC）为治疗药物，观察其对DM大鼠心肌损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 40只清洁级雄性SD大鼠，体质量（body weight，BW）为（220±20）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（军）-2007-004，大鼠均在华北煤炭医学院实验动物中心屏障环境动物实验室喂养；STZ购自美国Sigma公司，柠檬酸三钠和柠檬酸购自北京市博爱科贸有限责任公司；组织切片机（RM2128），电子显微镜（日立 H-7500），冷冻低温离心机（TGL-16）。

1.2 EBC的制备 荞麦糠皮为甜荞麦子粒加工成米时产生的废料（来自内蒙古自治区通辽市库伦旗），其提取物制备方法为：糠皮加15倍量50%乙醇于60℃回流提取2h，过滤。再用10倍量50%乙醇于60℃回流提取1h，过滤。合并滤液，用旋转蒸发器回收乙醇，于60℃浓缩、干燥即得EBC。

1.3 DM模型的建立与动物分组 40只SD大鼠以普通饲料适应性喂养1周，随机取7只大鼠作为正常对照组。其余33只大鼠给予高脂饲料（饲料中含有10%蔗糖、10%猪油和5%胆固醇）喂养12周，腹腔注射20mg·kg－1STZ建立大鼠T2DM模型。同时正常对照组大鼠腹腔注射柠檬酸－柠檬酸钠溶液。72h后检测大鼠空腹血糖fasting blood，glucose，FBG）， 将 FBG 在10mmol·L－1以上作为造模成功指标。成模大鼠23只，分成模型对照组（8只）、贝那普利治疗组（8只）和 EBC治疗组（7只）。①正常对照组：10mL·kg－1·d－1纯净水灌胃；②模型对照组：10mL·kg－1·d－1纯净水灌胃；③EBC治疗组：200mg·kg－1·d－1EBC灌胃；④贝那普利治疗组：4mg·kg－1·d－1贝那普利灌胃。各组大鼠每天给药1次，连续8周。

1.4 大鼠FBG水平的测定[6]各组大鼠于给药前、给药后8周，空腹8h后断尾取血，分别用快速血糖测试仪测定各组大鼠FBG水平。

1.5 大鼠血液动力学指标的测定 大鼠心脏功能通过测定左心室心率（HR）、左室收缩压（LVSP）、左心室舒张期末压（LVEDP）、左室内压最大上升下降速率（±dp/dtmax）来判断，＋dp/dtmax和LVSP反映心脏的收缩功能；－dp/dtmax和LVEDP反映心脏的舒张功能。实验日大鼠隔夜禁食不禁水，各组大鼠给予乌拉坦腹腔麻醉，仰卧固定四肢，于颈部偏右纵向切开皮肤，逐层分离并暴露右侧颈总动脉1.5cm，远心端用线结扎，然后将已准备好的充满生理盐水和肝素的导管向心脏方向插入，并用丝线结扎固定。压力信号经压力传感器输入至BL420生物系统，自动记录大鼠HR，稳定5min后，导管进一步插入左心室，记录大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax。取出大鼠心脏，冰盐水冲洗，滤纸吸干后称质量。测量心脏质量指数（HWI），HWI＝心脏质量（mg）/BW（g）。

1.6 大鼠心肌组织形态学观察 取左室心尖部心肌组织放入10%中性甲醛溶液固定，梯度酒精脱水、浸蜡、包埋、切片，片厚4μm，HE染色，光镜下观察大鼠心肌组织形态学。

1.7 统计学分析 采用SPSS 10.0软件进行统计处理。各组大鼠BW、HWI、FBG、HR、±dp/dtmax、LVSP和LVEDP以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 正常对照组大鼠精神状态良好，BW增加明显，反应敏捷，毛色白而光泽。模型对照组大鼠出现不同程度的多食、多尿、多饮和消瘦等症状，BW增加缓慢，精神萎靡，反应迟钝，皮毛无光泽。与模型对照组比较，贝那普利治疗组和EBC治疗组大鼠情况明显改善。

2.2 各组大鼠BW、HWI和FBG 与正常对照组比较，模型对照组大鼠FBG和HWI显著升高（P＜0.01），BW 明显下降（P＜0.01）。与模型对照组比较，贝那普利和EBC治疗组大鼠HWI及FBG均显著下降（P＜0.01），而BW 明显升高（P＜0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠血流动力学指标 与正常对照组比较，模型对照组大鼠LVEDP升高（P＜0.01），而LVSP、HR和±dp/dtmax明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。与模型对照组比较，贝那普利和EBC治疗组大鼠 LVEDP明显下降（P＜0.05），而LVSP、HR和±dp/dtmax明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

表1 各组大鼠BW、HWI和FBGTab.1 BW，HWI，and FBG of rats in various groups （±s）

表1 各组大鼠BW、HWI和FBGTab.1 BW，HWI，and FBG of rats in various groups （±s）

＊ P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05 vs model control group.

Group n BW（m/g） HWI[wB/（mg·g－1）]FBG[cB/（mmol·L－1 0.18 Model control 8 217.80±10.88＊ 4.56±0.34＊ 20.97±0.46＊Benazepril treament 8 237.40±9.24△ 3.76±0.12△ 11.00±0.73△EBC treament 7 250.00±9.35△ 3.28±0.24△ 15.15±0.66）]Normal control 7 244.80±1.64 2.66±0.20 6.30±△

表2 各组大鼠血液动力学指标Tab.2 Hemodynamic indexes of rats in various groups

2.4 各组大鼠心肌组织病理形态学 HE染色结果：光镜下可见正常对照组大鼠心肌纤维排列整齐，无肥大，心肌细胞形态正常，细胞间界限清晰，细胞间质和微血管正常；细胞核呈圆形或椭圆形，居于细胞中央，心肌间质结构正常。模型对照组大鼠心肌纤维排列紊乱，心肌细胞间界限不清，心肌细胞明显肿胀、肥大、变性、细核核明显增大，心肌细胞间成纤维细胞增生，胶原纤维增加；可见局部炎性细胞浸润，心肌细胞坏死。EBC和贝那普利治疗组大鼠心肌纤维紊乱和心肌细胞肿胀减轻，心肌纤维肥大不多见，结构正常，心肌细胞边界清楚，细胞核呈圆形或椭圆形，心肌间质结构正常，病变程度有所改善。见图1（插页五）。

3 讨 论

DM根据发病的机理不同被分成4种类型：1型糖尿病、T2DM、特异型DM和妊娠期DM。其中T2DM占DM总发病率的90%，本研究成功制备T2DM模型[7]。STZ对组织毒性小，是目前国内外使用较多的一种制备DM模型的药物。腹腔一次性大剂量注射STZ所制备的速发型DM模型系β细胞直接受损所致，目前被广泛采用[8]。本实验选用SD大鼠腹腔注射STZ和喂食高脂饲料建立T2DM大鼠模型，大鼠表现为血糖升高、胰岛素敏感性下降等典型的T2DM特征。同时应用EBC作为治疗药物，观察EBC对T2DM大鼠心肌损伤的影响。

本实验结果表明：模型对照大鼠HWI较正常对照组明显增高，表明此时DM大鼠已出现心肌肥厚。而且DM大鼠心脏的收缩功能和舒张功能均发生障碍，表现为LVSP、HR和±dp/dtmax均明显下降，而LVEDP升高。＋dp/dtmax主要反映心肌的收缩功能，而－dp/dtmax反映心肌的舒张功能，因此本实验结果很好地说明：用STZ加高糖高脂建立的T2DM大鼠模型心肌功能的确发生了障碍。而且大鼠心肌组织形态学研究结果表明：DM大鼠心肌组织形态学也发生了改变。

有研究[9]报道：在STZ诱异的DM大鼠模型心肌中 Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-ATPase和 Mg2＋－ATPase活性明显降低，总抗氧化能力显著减弱，细胞超微结构受损，这种DM早期心脏的代谢和结构异常可能是DM心肌病的基础。在DM高血糖状态下，细胞多元醇代谢通路激活，使山梨醇聚集，肌醇代谢紊乱，Na＋-K＋-ATPase活性下降，导致细胞内葡萄糖转运障碍，能量生成不足，功能异常。此外，肌浆网是心脏收缩的关键因素，是胞浆游离钙的主要调节者，90%的游离钙都来自于与Ryanodine受体相偶联的肌浆网的钙释放，在心脏舒张过程中，肌浆网的 Ca2＋-ATP酶和钙泵（SERCA2a）运出这部分钙[10]。而其抑制蛋白-受磷蛋白（PLB）是肌浆网功能的重要调节者[11]，其非磷酸化状态可以通过降低与Ca2＋的亲和力而抑制SERCA2a的功能，而其磷酸化状态相反。因此，众多因素影响了DM大鼠的心肌功能。使用EBC处理DM大鼠后，大鼠LVSP、HR和±dp/dtmax均明显升高，而LVEDP显著下降，且EBC对心肌的病理改变起到了保护作用。关于EBC对DM大鼠心肌的保护机制是否作用于上述环节尚待进一步研究。

本实验结果提示：EBC对STZ诱导的DM大鼠心肌损伤具有一定的保护作用。本研究结果将为进一步阐明DM所致心肌病的发病机制，亦为EBC用于预防和治疗DM以及DM所致心肌病提供依据。

[1]黄娅茜，王 宪，孔 炜，等.糖尿病心肌病发病机制的研究进展 [J].生理科学进展，2010，41（1）：31-36.

[2]白 静，吕 华，韩淑英，等.荞麦糠皮提取物对糖尿病大鼠肾损伤的抑制作用研究 [J].食品科学，2010，31（27）：276-279.

[3]刘淑梅，韩淑英，张宝忠，等.荞麦种子总黄酮对糖尿病高脂血症大鼠血脂、血糖及脂质过氧化的影响 [J].中成药，2003，8（25）：662-663.

[4]尚保华，韩淑英，郑丽坤，等.荞麦花叶总黄酮对大鼠2型糖尿病胰岛素抵抗的影响 [J].时珍国医国药，2009，20（10）：2468-2470.

[5]辛 念，齐亚娟，韩淑英，等.荞麦花总黄酮对2型糖尿病大鼠高脂血症的作用 [J].中国临床康复，2004，8（27）：5984-5985.

[6]Gou XB，Han SY，Xu JM，et al.Effect of total flavones of buckwheat flowers and leaves on protein tyrosine phosphatase 1Bexpression in type 2diabetic rats[J].Latin Am J Pharm，2011，30（7）：1377-1382.

[7]郭啸华，刘志红，李 恒，等.实验性Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立 [J].肾脏病与透析肾移植杂志，2000，9（4）：351-355.

[8]谭庆华.正常糖耐量与合并2型糖尿病的冠心病患者胰岛功能及胰岛素抵抗指数观察 [J].华夏医学，2005，18（1）：12-14.

[9]廖儒佳，曹雯雯，张 伟.蛋白磷酸酶I与Ca2＋/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ在心肌病中研究进展 [J].中国药理学通报，2012，28（12）：1629-1633.

[10]Sabine F，Christian T， Wolfram HZ，et al.Increased myocardial SERCA expression in early type 2diabetes mellitus is insulin dependent：Invivoandinvitrodata[J].Cardiovasc Diabetol，2012，11（57）：1-11.

[11]Jorge S，Brian S，Wolfgang HD.Conditional increase in SERCA2aprotein is able to reverse contractile dysfunction and abnormal calcium flux in established diabetic cardiomypathy[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2008，295（5）：1439-1445.