乳鼠心肌微血管内皮细胞体外原代培养与鉴定的实验研究

张颖倩，胡舜英，陈韵岱

血管内皮细胞作为血管最内层细胞，直接接触血液，具有保持血管的完整性与稳定性，抗血小板聚集、维持血管张力等生理功能。心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)与大血管内皮细胞及各脏器微血管内皮细胞之间表现出不同的功能异质性［1］。CMECs可通过分泌活性物质直接影响心肌细胞［2］，并参与缺血/再灌注损伤［3］、无复流现象等病理生理过程。原代CMECs的分离培养对研究缺血/再灌注损伤、微血管功能障碍、冠心病的治疗等有重要意义。本实验在Peters实验［4］的基础上进行了改进，在保证细胞纯度的前提下进一步提高了CMECs的收获率，成功分离并培养了纯度、成活率均较高的原代CMECs。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 CO2培养箱(Heraeus)，超净台(北京亚泰科隆)，酶标仪(Biotec)，摇床(北京欧诺)，倒置荧光显微镜(Olympus)，流式细胞仪(B＆D)。

1.2 实验动物与试剂 SD大鼠乳鼠，5～7 d，体重12～15 g，雌雄不限，购自解放军总医院实验动物中心，动物许可证编号:SCXK(京)2012-0001。高糖DMEM干粉(Gibco)，Ⅰ型胶原酶(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，PBS(Hyclone)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Hyclone)，重组人血管内皮生长因子(VEGF，中科物源)，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体(中杉金桥)，兔抗鼠CD31多克隆抗体(中杉金桥)，FITC标记的山羊抗兔IgG(中杉金桥)，AnnexinⅤ-FITC＆PI凋亡检测试剂盒(嘉美生物)，二甲基亚砜(DMSO，Gibco)。

1.3 实验方法

1.3.1 乳鼠CMECs的分离与培养:乳鼠脱臼处死，无菌条件下取左心室，放入冰浴PBS+肝素钠溶液中，眼科剪和眼科镊去除左心室外1/4层组织、心内膜、心外膜及瓣膜。沿室间隔剪开左心室，95%乙醇浸泡20 s，灭活残余的心内膜和心外膜细胞。PBS冲洗，将心肌组织剪为 0.5 mm ×0.5 mm ×0.5 mm的组织块。加0.2%Ⅰ型胶原酶5 ml，置于摇床内37℃振荡水浴20 min，吹打后加入0.25%胰酶5 ml，37℃振荡水浴5 min，再次吹打。200目金属筛网过滤，滤液用等体积基础培养基(90%DMEM+10%胎牛血清)中和，1000 r/min离心8 min。弃上清收集沉淀细胞，细胞重悬于培养液中，接种于培养瓶内，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。4 h后，去除悬浮的未贴壁细胞，加入完全培养基(80%DMEM+20%胎牛血清+10 ng/ml VEGF+100 U/ml青霉素+100 U/ml链霉素)继续培养已贴壁的CMECs。48 h更换一次完全培养基。细胞生长覆盖80%培养面时，0.25%胰酶消化，按1∶2比例传代。

1.3.2 细胞免疫组化染色进行细胞鉴定:将盖玻片平放于24孔板中，细胞悬液调整至1×105个/ml滴加于盖玻片上，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。待细胞生长覆盖80%培养面后，取出细胞爬片;PBS洗3次，每次5 min;4%多聚甲醛固定20 min;PBS洗3次，每次5 min;5%牛白蛋白室温封闭30 min;分别在两张细胞爬片上滴加兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体(1:100)和兔抗鼠CD31多克隆抗体(1:100)，阴性对照细胞爬片滴加等量PBS，放入湿盒内，37℃孵育4 h;PBS洗3次，每次5 min;于3张细胞爬片上分别滴加山羊抗兔IgG-FITC，37℃避光孵育30 min;PBS洗3次，每次5 min［5］。立即于倒置荧光显微镜下观察，每张爬片计数10个视野，计算其平均数。

1.3.3 台盼蓝染色测定细胞存活率及AnnexinⅤ＆PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率:细胞生长覆盖80%培养面时，0.25%胰酶消化，用等体积基础培养基(90%DMEM+10%胎牛血清)中和，1000 r/min离心8 min。弃上清收集沉淀细胞，细胞重悬于培养基中，并吹打均匀。90 μl细胞悬液与10 μl 0.4%台盼蓝染液混匀，染色3 min，于倒置相差显微镜下观察，死细胞染成蓝色，活细胞呈无色透明状［6］。统计细胞活力:活细胞率(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。重复3次，取其平均值。细胞生长覆盖80%培养面时，0.25%胰酶消化，用等体积基础培养基中和，1000 r/min离心8 min。弃上清收集(1～5)×105细胞，用预冷PBS(4℃)重悬细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，加500 μl Binding buffer 重悬，加入 5 μl AnnexinⅤ-FITC染液混匀并避光，室温孵育15 min;加入5 μl PI染色5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率及存活率［7］。重复3次，取其平均值。

1.3.4 MTT法绘制细胞生长曲线:细胞按104/孔接种于 96孔板中培养 24 h，向4复孔中加入5 mg/ml MTT 溶液 10 μl，37℃继续培养 4 h;弃掉培养基，每孔加入 150 μl DMSO，避光振荡 10 min，于酶标仪570 nm波长处检测光吸收值［8］。每24 h测定4复孔的光吸收值。计算每个复孔吸光度平均值并绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 CMECs培养结果细胞贴壁培养4 h后弃去上清，PBS冲洗后加入完全培养基继续培养，可见细胞贴壁生长。原代乳鼠CMECs培养24 h可见短梭形、三角形、多边形细胞聚集呈管腔样生长。72 h见原代培养乳鼠CMECs铺满，呈铺路石样，见图1。铺路石样及管腔样生长皆为血管内皮细胞的典型生长特点。

图1 光镜观察乳鼠心肌微血管内皮细胞培养结果(×40)

2.2 CMECs鉴定结果 在倒置荧光显微镜下观察，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体免疫荧光染色后，胞浆内呈绿色荧光，见图2。兔抗鼠CD31多克隆抗体免疫荧光染色后，胞膜呈绿色荧光，见图3。阴性对照细胞不能观察到荧光。Ⅷ因子及CD31双阳性证实为微血管内皮细胞，双阳性者＞95%。分离培养的乳鼠CMECs纯度很高。

2.3 CMECs台盼蓝染色及AnnexinⅤ＆PI双标记流式细胞术结果 台盼蓝染色后进行细胞计数，重复3次，计数活细胞率平均值＞95%，25 cm2培养瓶细胞数达7×106/瓶。AnnexinⅤ＆PI双标记流式细胞术检测存活细胞率＞95%，见图4。

图2 乳鼠心肌微血管内皮细胞(兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体免疫荧光染色×200)图3 乳鼠心肌微血管内皮细胞(兔抗鼠CD31多克隆抗体免疫荧光染色×200)

图4 AnnexinⅤ-FITC＆PI染色流式细胞术检测细胞存活率

2.4 CMECs生长曲线 MTT法连续11 d检测细胞增殖情况，并绘制细胞生长曲线，见图5。于培养3～5 d进入对数生长期，培养 5～7 d为生长平台期。

图5 乳鼠心肌微血管内皮细胞生长曲线

3 讨论

目前，培养原代CMECs的方法主要有磁珠筛选法［9］、植块培养法［10-12］和双酶消化法［4，13］。磁珠筛选法对仪器、技术要求较高，需要连接有抗体的磁珠，成本高且细胞收获率低。植块培养法分离操作较简单，对实验条件无特殊要求，分离细胞成本低，但培养时间长，原代细胞生长覆盖80%培养面需5 ～7 d，且培养皿需用鼠尾胶原［14］或明胶［15］等处理以促进血管内皮细胞的爬出与贴壁，增加了操作步骤及污染概率。Peters等［4］采用双酶消化法分离并纯化原代微血管内皮细胞，并通过物理法、化学法、差速贴壁法纯化内皮细胞，可在较短时间内获得纯度较高的原代微血管内皮细胞。心脏组织的内皮细胞分为大血管壁内皮细胞，微血管内皮细胞和心内膜、心外膜内皮细胞，三者在功能与结构上均存在着异质性［16-17］。为了得到高纯度的 CMECs，心内膜、心外膜内皮细胞和大血管壁内皮细胞是必须去除的。在Peters的实验中，剪除心房、瓣膜、右心室、室间隔、心内膜以去除心内膜、心外膜内皮细胞;剪除左心室外1/4层心肌以去除心外膜及大血管内皮细胞。将剩余组织于95%乙醇中处理，进一步灭活剩余的心内膜和心外膜内皮细胞。使用胶原酶孵育使心脏组织松散，吹打过程促进了内皮细胞与成纤维细胞、心肌细胞的分离。胰酶与胶原酶共同孵育消化，能促进破坏成纤维细胞。并根据内皮细胞贴壁较心肌细胞贴壁快的原理，在内皮细胞大量贴壁后，去除上清并用预热的PBS冲洗，将贴壁的细胞继续培养，利用差速贴壁法纯化微血管内皮细胞。

本实验在Peters实验的基础上进一步改进了实验步骤:①选用5～7 d龄的SD乳鼠，细胞的增殖分裂能力较3月龄的大鼠细胞强。虽然对心脏的解剖及心房、瓣膜、右心室、室间隔、心内膜及左心室外1/4层心肌的去除操作要求较高，但练习后可以较好完成。②将其实验中胶原酶的孵育时间自10 min延长至20 min，并置于180 g/min、37℃的摇床孵育，增加了组织块与胶原酶的接触时间与面积，进一步促进了内皮细胞与非内皮细胞的分离。③将初次分离的细胞悬液培养时间自1 h延长至4 h后去除上清，增加了贴壁的细胞数量。且经Ⅷ因子及CD31双鉴定纯度＞95%，在保证纯度的前提下提高了CMECS的收获率。④有研究指出，心肌成纤维细胞的分裂增殖速度较微血管内皮细胞快［18］，故于培养基中加入10 ng/ml VEGF促进微血管内皮细胞的生长，可对成纤维细胞生长造成抑制，以提高微血管内皮细胞的纯度。⑤成纤维细胞贴壁较微血管内皮细胞牢固，在传代过程中，采用差速消化法，于0.25%胰酶消化2 min时及时终止消化，可以进一步去除贴壁较牢的成纤维细胞。本实验成功分离并培养了纯度、成活率均较高的原代CMECs，为缺血/再灌注损伤、微血管功能障碍、冠心病相关治疗等的体外研究提供了良好的实验基础。

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