Snail和N-cadherin在乳腺浸润性导管癌中的表达

曹 莉，熊正文，黄 勇，韩亚伟，苏 红，张华东，李 伟

研究发现肿瘤细胞的浸润转移是患者病死率较高的一个重要原因，上皮细胞－间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和癌细胞脱离原发部位在浸润转移过程中起重要作用［1］。Snail和N-cadherin异常的表达是EMT发生的一个重要机制，增加了癌细胞的侵袭转移性［2］。现探讨Snail和N-cadherin在乳腺不同病变组织中的表达变化差异、与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系以及它们的相关性，旨在探讨其在乳腺癌发生、发展和浸润转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 标本来源 解放军251医院病理科于2008年1月—2009年12月收集乳腺普通型增生、乳腺导管内癌组织标本各30例，乳腺浸润性导管癌80例。乳腺普通型增生年龄28～56岁，中位数42岁。乳腺导管内癌年龄30～62岁，中位数48岁;低级别癌8例，中级别癌15例，高级别癌7例，均无淋巴结转移。乳腺浸润性导管癌年龄22～75岁，中位数50岁;组织学分级Ⅰ～Ⅱ级55例，Ⅲ级25例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期54例;有淋巴结转移46例，无淋巴结转移34例。术前均未接受化疗、激素治疗及放疗。

1.2 主要试剂 兔抗人Snail多克隆抗体购自Abcom 公司(17732)，N-cadherin(MAB-0571)、免疫组化SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 免疫组化染色(SP法) 标本均经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，采用0.01 mmol/L的枸橼酸缓冲液抗原修复，染色程序按SP试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片为阳性对照。

1.4 结果判定 Snail免疫组化阳性信号以胞核出现棕黄色为阳性细胞，按染色强度的深浅积分，0分:无染色，1分:弱阳性，2分:强阳性;按着色细胞百分比积分，1分:≤25%，2分:26% ～50%，3分:51% ～75%，4分:＞75%;按照阳性细胞×染色强弱计积分，积分1～2分为阴性，3～8分为阳性［3-4］。

N-cadherin阳性表达为细胞膜及细胞质内出现棕黄色颗粒，光镜下每张切片随机选取10个400倍视野，每个视野计数100个细胞。阳性细胞数评分:阳性细胞数≤10%为0分，11% ～25%为1分，26% ～50%为2分，≥51%为3分。染色强度评分:无着色为0分，淡棕黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分。将两项评分相乘，结果≤2分为阴性，＞2分为阳性。

1.5 统计学分析 数据采用SPSS 17.0统计分析软件处理，计数资料运用χ2检验、Spearman相关性检验分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 Snail、N-cadherin在不同乳腺病变中的表达乳腺浸润性导管癌组织中，Snail阳性率为82.5%(66/80)，分别高于乳腺导管内癌组织53.3%(16/30)和乳腺普通型增生组织13.3%(4/30)，差异有统计学意义(χ2=9.78，P ＜0.01 和 χ2=45.11，P ＜0.01);乳腺浸润性导管癌组织中，N-cadherin阳性率为60.0%(48/80)，分别高于乳腺导管内癌组织26.7%(8/30)和乳腺普通型增生组织10.0%(3/30)，差异有统计学意义(χ2=9.70，P ＜0.01 和χ2=12.97，P ＜0.01)，见图1、2。

2.2 Snail、N-cadherin在乳腺浸润性导管癌中表达与临床病理指标的关系 Snail和N-cadherin在淋巴结转移组中、TNM分期中Ⅲ～Ⅳ表达明显较无淋巴结转移组、TNM分期中Ⅰ～Ⅱ高，差异有统计学意义(P＜0.01);Snail和N-cadherin与患者年龄、肿瘤直径大小、组织学分级均无关(P＞0.05)，见表1。

图1 Snail在不同乳腺病变中的阳性表达(SP×200)

图2 N-cadherin在不同乳腺病变中的阳性表达(SP×200)

2.3 乳腺浸润性导管癌组织中Snail、N-cadherin表达之间的关系 乳腺浸润性导管癌中Snail和N-cadherin表达同时阳性者45例，同时阴性者11例，Snail阳性、N-cadherin阴性者21例，Snail阴性、N-cadherin阳性者3例，两者呈显著正相关(r=0.36，P＜0.01)。

3 讨论

3.1 Snail、N-cadherin在乳腺不同病变组织中的表达情况 Snail首先被发现存在于果蝇中，是锌指蛋白超家族的第一个成员，人Snail基因定位于第20号染色体 20q12.3，全长 5882 bp，包含 3个外显子［5］。Snail与E-cadherin启动子区的E盒(E-box)结合，抑制E-cadherin的表达，诱导EMT的发生［6］。本研究显示Snail在乳腺浸润性导管癌中的阳性表达率高于乳腺导管内癌、乳腺普通型增生。N-cadherin是钙黏附素家族中第一个在中枢神经系统发现的成员，其编码基因定位于人染色体18ql1.2，分子量为127 kD，全长4132 bp，由906个氨基酸组成［7］。在成熟组织中，N-cadherin只表达在神经外胚层和中胚层来源的组织，如成熟的神经、肌肉和造血组织等。N-cadherin的表达有助于上皮细胞－间质细胞的迁移，从而使肿瘤细胞更加富于侵袭力，易于转移［8］。本研究显示N-cadherin在乳腺浸润性导管癌阳性表达率高于乳腺导管内癌、乳腺单纯性增生。提示Snail和N-cadherin蛋白在乳腺癌中的异常表达对其发生、发展可能起重要作用。

3.2 乳腺癌组织中Snail、N-cadherin的表达与临床病理指标的关系 研究发现EMT在各种上皮细胞来源的恶性肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要作用，而Snail可以诱导EMT的发生，因此Snail在肿瘤转移中的作用越来越受到人们的关注。本研究发现乳腺癌组织中Snail表达与年龄、肿瘤大小和组织学分级无关，与淋巴结转移、TNM分期表达差异有统计学意义。结果提示，Snail高表达与乳腺癌发生、浸润转移密切相关，与Come等［9］的实验结果基本一致。Snail在肿瘤中的表达越高，肿瘤的转移能力可能也随之增高，癌细胞更容易侵袭周围组织并发生转移，故其高表达可能提示预后不良。

本研究发现乳腺浸润性导管癌组织中N-cadherin表达与年龄、肿瘤大小和组织学分级无关，与淋巴结转移、TNM分期表达差异有统计学意义。提示随着肿瘤转移能力的增强，N-cadherin表达逐渐升高。N-cadherin的增加可以通过 FGFR激活MAP-KERK信号转导途径，诱导MMP-9基因表达，有利于肿瘤血管的形成，使肿瘤易于生长和转移［10-11］。体外实验也表明，给N-cadherin阴性表达的癌细胞转染N-cadherin后，细胞的侵袭力明显增强［12］。进一步说明 N-cadherin在乳腺癌浸润和转移过程中可能起着重要的作用，可以作为乳腺癌发生、发展以及浸润转移的指标。

表1 Snail、N-cadherin在乳腺浸润性导管癌中表达与临床病理指标的关系

3.3 乳腺浸润性导管癌中Snail、N-cadherin表达的相关性 Snail与许多靶基因相互作用，而其中E-cadherin被认为是最重要的靶基因。Snail可与E-box结合，在转录水平上抑制E-cadherin的表达，诱导N-cadherin的高表达。随着对经典的cadherin分子深入研究发现，N-cadherin表达的增多，在引起肿瘤浸润转移方面有着比E-cadherin减少更为重要的作用，故在肿瘤的恶性生物学行为中，N-cadherin起着更重要的作用［13］。本研究发现，乳腺浸润性导管癌组织中Snail、N-cadherin表达变化一致上调，呈明显正相关。因此，Snail可能间接导致N-cadherin的异常表达，从而导致上皮间连接的破坏，使癌细胞间黏附力减弱，更具有侵袭力。

综上所述，乳腺浸润性导管癌的浸润转移是多种因素共同作用的结果，其中Snail、N-cadherin的异常表达是一个主要因素，这两种基因共同参与乳腺肿瘤的发展及转移，它们可以共同作为判断乳腺癌转移和预后的参考指标。推测Snail可能作为转录因子，居于信号通路的中间环节，对其上游信号转导通路以及下游Snail转录调控基因进行调控，并诱导N-cadherin的异常表达。因而通过阻断Snail信号途径，采取针对Snail的干预方案，有望降低乳腺浸润性导管癌的浸润转移率，从而改善预后。

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