Midkine在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

尚培中，李晓武，蔡大伟，温艳春，谷化平，高占明

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，症状和体征缺乏特异性，早期诊断困难，确诊时大多已属中晚期，手术切除率较低，5年生存率不足5%，其高病死率与高侵袭、转移性密切相关［1-3］。研究证实，Midkine在肿瘤侵袭和转移过程中发挥了重要作用［4-6］。本研究应用免疫组化 EliVisionTMplus法对胰腺癌组织进行Midkine检测，旨在探讨其表达与胰腺癌临床病理指标的关系，为指导临床治疗提供理论依据，为判断预后提供客观标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集解放军251医院2000年3月1日—2010年2月28日胰腺癌根治性手术切除标本70例，男44例，女26例;年龄33～79岁，平均62.3岁。均经组织病理学诊断为原发性胰腺导管腺癌，其中高、中、低分化腺癌分别为25例、26例和19例;同时选取距肿瘤至少3 cm以上癌旁非肿瘤胰腺柔软组织标本15例。所有病例均无其他严重内科疾病或其他恶性肿瘤，术前未行化疗、放疗及免疫治疗。依据国际抗癌联盟(International Union for Cancer Control，UICC)第6 版标准［7］进行 TNM 分期。

1.2 方法 手术标本经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规制备4 μm厚切片，65℃烘烤备用。采用微波 －枸橼酸钠缓冲液修复抗原。兔抗人Midkine多克隆抗体、EliVisionTMplus免疫组化染色试剂盒、DAB显色液均购自迈新生物技术有限公司。免疫组化染色采用EliVisionTMplus法，染色步骤严格按照试剂盒说明书进行。用随试剂所附已知阳性对照片做阳性对照，癌旁胰腺组织标本做阴性对照，PBS溶液代替一抗做空白对照。

1.3 结果判断标准 在未知患者临床资料的情况下，由两位有经验的病理医师独立对染色切片进行观察并确认。在400倍光学显微镜下对每张切片任选5个视野进行观察。背景染色清晰，阳性细胞占细胞总数比率＞5%为阳性，≤5%为阴性。

1.4 统计学处理 所有数据均通过SPSS 17.0统计软件包进行分析。Midkine表达与胰腺癌临床病理指标的关系应用χ2检验，Kaplan-Meier法描绘生存曲线。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 Midkine在不同胰腺组织中的表达 在胰腺癌细胞中Midkine阳性反应主要定位于细胞质内，见图1A。15例癌旁胰腺组织中均未见Midkine表达，见图1B。Midkine在70例胰腺癌组织中阳性表达50例，阳性率为71.4%，阳性率显著高于癌旁胰腺组织(χ2=26.02，P ＜0.05)。

图1 Midkine在胰腺癌组织、癌旁胰腺组织中的表达(EliVisionTMplus法×200)

2.2 Midkine表达与胰腺癌临床病理指标的关系在性别、发病年龄及肿瘤生长部位方面，Midkine表达阳性率差异无统计学意义(P＞0.05);但在肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移方面，Midkine表达阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 Midkine表达与预后的关系 随访3年，1年累计总体生存率(overall survival，OS)为 40.0%(28/70)。其中，Midkine阳性患者1年累计生存率为19.6%，中位生存时间10个月，Midkine阴性患者1年累计生存率为79.2%，中位生存时间18个月。Midkine阴性患者预后明显好于阳性患者，差异有统计学意义(χ2=14.19，P ＜0.05)，见图2。

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的本质特征，也是影响患者预后的一个重要因素。细胞过度增殖和凋亡受抑制是侵袭和转移的主要机制，其能力强弱与癌基因的表达有关［8］。Midkine是1988年Kadomatsu等用差异杂交方法在视黄酸诱导的小鼠胚胎瘤细胞cDNA文库中筛选出的一种基因，它与多向因子(pleiotrophin，PTN)共同组成一个新的肝素结合生长因子(HBGFs)家族。由于其独特的结构、特殊的组织分布与抗凋亡、促血管新生等生物学功能，引起了肿瘤研究工作者的浓厚兴趣，使其成为目前研究的热点之一。Midkine在多种肿瘤组织内，如脑肿瘤、口腔鳞状细胞癌、唾液腺肿瘤、甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、胃肠道间质瘤、肝细胞癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫颈癌中表达水平异常升高，与肿瘤发展的进程及严重程度密切相关，被认为是一种多肿瘤的通用抗原［4-6，9-16］。

表1 Midkine表达与胰腺癌临床病理指标的关系

图2 Midkine表达阳性组与阴性组胰腺癌患者生存曲线

有关Midkine在胰腺癌组织中的表达有许多学者进行了研究。Yoshida等［17］采用Northern印迹技术研究发现胰腺癌组织中Midkine呈阳性表达，而正常成人组织中几乎无表达。徐军等［18］采用反转录PCR(RT-PCR)和荧光定量反转录PCR(qRTPCR)技术，对Midkine mRNA分别进行定性和定量测定，发现胰腺癌组织中Midkine mRNA表达明显高于癌旁组织。马松林等［19］应用免疫组化SP法对比研究了Midkine及核增殖标志物Ki-67在胰腺癌及正常胰腺组织中的表达，发现Midkine表达与肿瘤组织学分级、临床分期和淋巴结转移有关，认为Midkine可能发挥了促进肿瘤细胞增殖和抑制凋亡的作用。笔者应用免疫组化EliVisionTMplus法对比观察了胰腺癌和癌旁胰腺组织中Midkine的表达状况，发现其在胰腺癌组织中阳性率为71.4%，而在癌旁胰腺组织中均呈阴性表达，证实其在胰腺癌的发生、发展中具有一定作用。进一步观察发现，Midkine阳性表达与性别、年龄及胰腺癌生长部位无显著相关性，但与肿瘤大小、分化程度、临床TNM分期、淋巴结转移显著相关，提示Midkine表达与胰腺上皮细胞的恶性转化密切相关。Midkine在肿瘤细胞中表达越强，其恶性程度也随之增高，癌细胞更容易侵袭周围组织或发生转移，表明它是促进胰腺癌发生和发展的基因，其高表达是预后不良的标志。本组Midkine阴性表达的20例术后总体累积生存率明显高于阳性表达的50例，说明监测Midkine表达状况有助于更准确地估测预后。

在各种恶性肿瘤细胞中，Midkine基因呈高强度、高频率表达，且与患者预后密切相关，提示Midkine有可能成为肿瘤基因治疗的新靶点。通过基因药物阻断Midkine表达，抑制其作用途径，可以达到促进肿瘤细胞凋亡的目的。由于Midkine基因在肿瘤组织中优先表达，Midkine启动因子能被用于选择性地表达肿瘤中的有害基因，如将胰腺癌Midkine基因5＇调控区域长约609对碱基的基因片断经单纯疱疹病毒胸苷激酶转导后，显著提高了癌细胞对药物前体及更昔洛韦的敏感性，从而影响肿瘤生长，故可将该段基因作为一种自杀基因片段［17，20］。Takei等［21］根据Midkine的二维结构设计了硫化磷酸酯修饰的反义寡脱氧核糖核苷酸(antisense oligodexynucleotides，asODN)，在体外和动物实验中用于鼠结肠癌细胞及神经纤维瘤细胞等肿瘤基因治疗，发现可明显抑制细胞增生及琼脂集落形成;将细胞种植于裸鼠，所形成的肿瘤明显小于对照组。Midkine asODN主要是通过适度抑制肿瘤细胞的有丝分裂及肿瘤的血管生成来抑制肿瘤的生长，此项实验提示Midkine asODN将来可能成为基因治疗的靶向药物之一。Inoh等［22］将阿霉素结合的抗 Midkine单克隆抗体与阿霉素共轭控制免疫球蛋白G进行对比研究，发现前者对人肝癌细胞(HepG2)生长的抑制作用强于后者，但其对胰腺癌的作用如何尚待进一步研究。

综上所述，Midkine在癌旁胰腺组织中呈阴性表达，而在胰腺癌组织中多呈阳性表达。肿瘤越大、分化程度越低、淋巴结转移越早，患者的生存期越短，Midkine表达越强，说明Midkine与胰腺癌发生、发展密切相关。术后通过对胰腺癌组织、特别是手术切缘的免疫组化Midkine检测，有助于判断胰腺癌的生物学行为及患者预后，对指导临床开展多学科综合治疗具有一定实用价值。

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