韩 磊,叶 平,李鸣皋
随着社会逐渐向老龄化发展,衰老的机制及防护也成为广大学者研究的热点。研究表明[1-4],他汀类药物作为临床应用最广泛的调脂药物,还有许多调脂之外的作用,如抗炎、保护内皮细胞、逆转左室重构、抑制动脉粥样硬化等。本研究以培养老年大鼠心肌细胞为研究对象,观察阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌细胞炎性因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达的作用与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)信号转导途径的关系,为研究心脏衰老的病理生理机制及其防治措施进行初步探索。
1.1 材料与试剂 Wister大鼠(北京维通利华公司),阿托伐他汀(大连辉瑞制药公司,批号:75837005),Ⅰ型胶原酶(Sigma公司),胰蛋白酶(Sigma公司),DMEM培养基(Gibco公司),二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液(Sigma公司),小牛血清(Gibco公司),GW9662(Sigma公司),RTPCR试剂盒(Takara公司),羊抗鼠 IL-1β一抗(美国Santa cruz公司),羊抗鼠GAPDH一抗(美国San-ta cruz公司),HRP兔抗羊二抗(美国Santa cruz公司),超敏发光液(北京普利来公司),CO2细胞培养箱(美国Thermo公司HEPA class 100型),超净工作台(北京半导体设备一厂),倒置显微镜(Olympus),PCR仪(美国Bio-Rad公司2720型),垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司Power PacTMBasic),核酸分析仪(美国Beckman公司DU-640型),台式冷冻高速离心机(美国Beckman公司),全自动凝胶分析系统(美国Bio-Rad公司Gel Doc 2000型)。
1.2 老年大鼠原代心肌细胞的分离培养 30只10月龄的Wister大鼠,雌雄各半,饲养至24月龄时作为实验对象,体重(637.3±60.1)g。以2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠,常规消毒后,剪开大鼠胸腔,迅速取出心脏并分离左室心肌。将心肌组织剪成1 mm3大小的组织块后,以0.1%胰蛋白酶和0.1%的Ⅰ型胶原酶消化心肌组织。消化下来的细胞悬液以80目筛网过滤,在室温下离心后,收集细胞以DMEM培养液重悬,调整细胞浓度至2×105/ml。将细胞接种于培养瓶中,以差速贴壁法去除非心肌细胞后,将心肌细胞移至新培养瓶中继续培养。
1.3 实验分组及处理 分别以DMSO溶解阿托伐他汀和GW9662。将培养的老年大鼠心肌细胞编号后随机分为4组,每组10只。即阿托伐他汀组、阿托伐他汀+GW9662组、溶剂对照组、空白对照组。各组分别给予以下处理:①阿托伐他汀组:加入配制好的阿托伐他汀溶液,使培养液中阿托伐他汀的浓度为10 μmol/L,置于培养箱中,培养12 h;②阿托伐他汀+GW9662组:加入PPARγ拮抗剂GW9662溶液,使其在培养液中的浓度为5 μmol/L,培养0.5 h后,再加入阿托伐他汀溶液,使其在培养液中的浓度为10 μmol/L,置于培养箱中培养12 h;③溶剂对照组:细胞培养液中加入等体积的DMSO溶液,置于培养箱中培养12 h;④空白对照组:加入等体积DMEM细胞培养液,置于培养箱中培养12 h。
1.4 RT-PCR方法检测各组心肌细胞IL-1β mRNA表达水平
1.4.1 引物合成:由赛百盛生物技术公司合成,序列见表1。
表1 合成引物序列及扩增产物分子量
1.4.2 RT-PCR反应:以TRIzol一步法提取各组老年大鼠心肌细胞的总RNA。严格按RT-PCR试剂盒的程序操作:①将各样本的RNA反转录成cDNA,反应条件为:42℃、30 min→99℃、5 min→5℃、5 min;②分别用相应的引物扩增IL-1β及GAPDH。其中,IL-1β 的PCR 反应条件为:95℃、5 min,94℃、45 s→50℃、1 min →72℃、1 min(33个循环),72℃、8 min;③PCR产物以2%琼脂糖凝胶进行电泳后,在图像分析仪下扫描,以IL-1β与GAPDH的光密度之比作为IL-1β mRNA的相对表达量。
1.5 Western bolt方法测定各组IL-1β蛋白含量按照以下步骤进行:①样本细胞用4℃的PBS洗涤3次;②加入单去污裂解液,冰上裂解30 min;③取裂解液,4℃下12 000 g离心5 min;④吸取上清液,加入loading buffer后煮5 min,置于-80℃冰箱备用;⑤另取少量上清液,用核酸分析仪测定其蛋白浓度,计算各样品的上样量;⑥各样本根据上样量进行上样,60 V电压下进行垂直电泳和转膜;⑦5%脱脂奶粉封闭1 h,膜入羊抗鼠一抗中,4℃过夜;⑧洗膜后加入兔抗羊二抗,室温下孵育2 h;⑨洗膜后加入发光液,于暗室中进行曝光反应。用图像分析软件进行分析,将IL-1β条带与GAPDH灰度值与面积的乘积之比,作为其IL-1β蛋白的相对含量。
1.6 统计学处理 所有数据均用SPSS 13.0统计软件包处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析,α=0.05为检验水准。
2.1 心肌细胞的培养 老年大鼠心肌细胞培养成功,在显微镜下,心肌细胞多表现为杆状或者矩形,表面有清晰的横纹,少量的心肌细胞呈现为类圆形,见图1。
图1 老年大鼠心肌细胞(×400)
2.2 心肌细胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比较 各组IL-1β mRNA表达水平、IL-1β蛋白含量见图2、3及表2。与空白对照组相比,溶剂对照组大鼠心肌细胞的IL-1β mRNA表达水平及IL-1β蛋白含量均无显著差异(P>0.05);阿托伐他汀组IL-1β mRNA表达水平及IL-1β蛋白含量均低于空白对照组、溶剂对照组(P<0.01);阿托伐他汀 +GW9662组的IL-1β mRNA表达水平及IL-1β蛋白含量均高于阿托伐他汀组(P<0.05),但仍显著低于空白对照组、溶剂对照组(P<0.05或P<0.01)。
图2 老年大鼠心肌细胞IL-1β mRNA RT-PCR结果
图3 老年大鼠心肌细胞IL-1β蛋白含量电泳结果
表2 各组大鼠心肌细胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比较(±s)
表2 各组大鼠心肌细胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比较(±s)
注:IL-1β mRNA表达水平为IL-1β与GAPDH光密度之比,IL-1β蛋白含量为IL-1β与GAPDH灰度值之比。与空白对照组比较,aP<0.05,bP<0.01;与溶剂对照组比较,cP <0.05,dP <0.01;与阿托伐他汀组比较,eP<0.05
组别 鼠数IL-1β mRNA表达水平IL-1β蛋白含量阿托伐他汀组 10 0.439 ±0.096bd0.233 ±0.062bd 10 0.726 ±0.132 0.604 ±0.123阿托伐他汀+GW9662组 10 0.568 ±0.104ace0.348 ±0.114bde空白对照组 10 0.698 ±0.119 0.570 ±0.121溶剂对照组
近年来,心肌细胞的体外培养技术正日渐成为研究心脏结构、功能与心血管疾病发生发展机制的重要手段[5-7]。受技术水平的限制,国内多数情况下是用乳鼠的心肌细胞进行培养,鲜见以衰老心肌细胞进行体外培养来开展研究的报道。然而,乳鼠的心肌细胞在代谢和功能方面毕竟不同于衰老心肌细胞,为准确反应衰老心肌的特点及对干预因素的反应,特进行了研究。
本研究中,阿托伐他汀组心肌细胞的IL-1β表达水平显著低于空白对照组,提示阿托伐他汀有着显著的抗炎作用,这同以往的研究是一致的。本研究发现阿托伐他汀在自然衰老的生理条件下,也具有抗炎等保护作用。既往研究表明,炎症因素在心脏衰老的病理生理过程中起着重要的作用,心肌细胞产生炎症因子后,可直接导致心脏的衰老性改变[8-10]。如炎症因子可与活性氧协同促进和诱导心血管系统的衰老[11];炎症因子在体内的含量随年龄增加而增多,其可通过多条通路介导机体的氧化应激状态,进而导致心血管系统的老化[12]。因此,在自然衰老状态下,阿托伐他汀抑制炎症因子表达,提示其可能具有抑制心肌老化改变的作用。
已有的研究证实,阿托伐他汀干预可抑制IL-1β 等炎性因子的表达[13-14],还可显著上调 PPARγ的表达水平[15]。为明确究竟是阿托伐他汀使得PPARγ信号通路激活,进而抑制了IL-1β等炎性因子的表达,还是阿托伐他汀先抑制了炎性因子IL-1β的表达,进而激活了PPARγ信号转导途径,本研究采用PPARγ拮抗剂GW9662来阻断PPARγ信号转导途径,然后观察阿托伐他汀抑制IL-1β表达的作用有无受到影响。结果显示,给予GW9662阻断PPARγ信号转导途径后,衰老心肌中IL-1β的表达显著增强。这一结果提示,通过阻断PPARγ信号转导途径,可部分抑制阿托伐他汀的抗炎作用。这也进一步提示阿托伐他汀使得PPARγ信号通路激活,进而抑制了IL-1β等炎性因子的表达。但在现阶段,阿托伐他汀是如何通过PPARγ信号通路来进抑制炎性因子IL-1β表达机制尚不清楚。
我们在研究中还发现,阿托伐他汀+GW9662组的IL-1β的表达水平虽高于阿托伐他汀组,但仍明显低于空白对照组。这一结果提示,虽然通过GW9662阻断了PPARγ信号转导途径,阿托伐他汀抑制IL-1β表达的作用仍未被完全阻断。这也进一步提示,激活PPARγ信号通路仅是阿托伐他汀抗炎作用的重要途径之一,但并不是唯一的途径。究竟在PPARγ信号通路以外,还存在哪些信号通路来介导阿托伐他汀抑制衰老心肌细胞中炎性因子表达的作用,目前尚不十分清楚,需要进一步加以研究。
[1]Jaiswal S R,Sontakke S D.Experimental evaluation of analgesic and anti-inflammatory activity of simvastatin and atorvastatin[J].Indian J Pharmacol,2012,44(4):475-479.
[2]Kotlega D,Ciecwiez S,Turowska K J,et al.Pathogenetic justification of statin use in ischaemic stroke prevention ac-cording to inflammatory theory in development of atherosclerosis[J].Neurol Neurochir Pol,2012,46(2):176-183.
[3]Yao J,Xiong M,Tang B,et al.Simvastatin attenuates pulmonary vascular remodelling by down-regulating matrix metalloproteinase-1 and 9 expression in a carotid artery-jugular vein shunt pulmonary hypertension model in rats[J].Eur J Cardiothorac Surg,2012,42(5):121-127.
[4]Rohilla A,Khan M U,Khanam R.Cardioprotective potential of simvastatin in the hyperhomocysteinemic rat heart[J].J Adv Pharm Technol Res,2012,3(3):193-198.
[5]Yu J Z,Bondy G P,Allard M F,et al.Serum from patients with chronic renal insufficiency alters growth characteristics and ANP mRNA expression of adult rat cardiac myocytes[J].J Mol Cell Cardiol,1996,28(12):2429-2441.
[6]Schluter K D,Goldberg Y,Taimor G,et al.Role of phosphatidylinositol 3-kinase activation in the hypertrophic growth of adult ventricular cardiomyocytes[J].Cardiovasc Res,1998,40(1):174-181.
[7]Clark W A,Decker M L,Behnke B M,et al.Cell contact as an independent factor modulating cardiac myocytes hypertrophy and survival in longterm primary culture[J].J Mol Cell Cardiol,1998,30(1):139-155.
[8]Chung H Y,Sung B,Jung K J,et al.The molecular inflammatory process in aging[J].Antioxid redox signal,2006,8(3-4):572-581.
[9]de Gonzalo C D,Neitzert K,Fernández M,et al.Differential inflammatory responses in aging and disease:TNF-alpha and IL-6 as possible biomarkers[J].Free Radic Biol Med,2010,49(5):733-737.
[10]Krieglstein K,Miyazono K,Dijke P,et al.TGF-β in aging and disease[J].Cell Tissue Res,2012,347(1):5-9.
[11]Sung B,Park S,Yu B P,et al.Amelioration of age related inflammation and oxidative stress by PPARγ activator:Suppression of NF-κB by 2,4-thiazolinedione[J].Exp Gerontol,2006,41(6):590-599.
[12]Domenighetti A A,Wang Q,Egger M,et al.AngiotensinⅡ-mediated phenotypic cardiomyocyte remodeling leads to age-dependent cardiac dysfunction and failure[J].Hypertrophy,2005,46(2):426-432.
[13]Sun T W,Zhang J Y,Li L,et al.Effect atorvastatin on serum tumor necrosis factor alpha and interleukin-1β following acute pulmonary embolism[J].Exp Lung Res,2011,37(2):78-81.
[14]Sun Y M,Tian Y,Li X,et al.Effect of atorvastatin on expression of IL-10 and TNF-alpha mRNA in myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,382(2):336-340.
[15]Yang P,Li Y,Li J J,et al.Up-regulating PPAR-γ expression and NO concentration,and down-regulating PAI-1 concentration in a rabbit atherosclerotic model:the possible antiatherogenic and antithrombotic effects of atorvastatin[J].Int J Cardiol,2005,139(3):213-217.