基于脑梗死大鼠模型的针刺指标对针刺效应影响的均值加权分类评价*

常晓波 樊小农 王舒 孟智宏 杨雪 石学敏,6

（1天津中医药大学第一附属医院 天津 300193；2国家中医药管理局针刺量效关系三级实验室 天津 300193；3国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室 天津 300193；4江西中医药大学附属医院 南昌 330006；5天津工业大学数理学院 天津 300387；6天津市针灸学重点实验室 天津 300193）

基于脑梗死大鼠模型的针刺指标对针刺效应影响的均值加权分类评价*

常晓波1,4樊小农1,2王舒1,3#孟智宏1杨雪5石学敏1,6

（1天津中医药大学第一附属医院 天津 300193；2国家中医药管理局针刺量效关系三级实验室 天津 300193；3国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室 天津 300193；4江西中医药大学附属医院 南昌 330006；5天津工业大学数理学院 天津 300387；6天津市针灸学重点实验室 天津 300193）

目的：评价针刺指标对大脑中动脉梗死（MCAo）大鼠模型的针刺效应的影响，以此来初步探讨针刺治疗脑梗死的作用机制，并为脑梗死针刺治疗方案提供理论依据。方法：本实验以Zea-1onga线拴法复制MCAo大鼠模型。造模成功后依据Zausinger六分法选择1～3分的大鼠随机入组。以随机对照设计原则设立基础对照组（正常组、模型对照组、模型未干预组）和针刺组（内关组、委中组、三阴交组、尺泽组、人中组和非穴组）。而且针刺组内每个穴组采用正交设计法分别设置9个不同参数组合。根据各组别所对应的针刺参数分别进行提插手法针刺治疗，每12小时1次，共干预6次。每组12只，共57组。并以神经行为学、脑血流、梗死率、微循环、光镜等为测量指标，评价针刺指标对MCAo大鼠模型的针刺效应的影响。结果：内关穴在降低梗死率、扩张输入枝管径、提高神经行为学评分表现的最突出；委中穴在增加脑血流、提高神经行为学方面表现最佳；尺泽穴在增加脑血流、扩张输出枝管径、提高正常神经细胞数方面表现最好；三阴交在减少坏死神经细胞和噬神经细胞、降低坏死神经细胞率、提高神经行为学评分方面表现最优。结论：针刺治疗脑梗死疗效确切，其机制可能是通过改善微循环、增加脑血流量、降低梗死率、降低坏死神经元细胞数、减少噬神经细胞数从而提高神经行为学评分来实现的，为脑梗死的针刺治疗方案提供理论依据。

大脑中动脉梗死大鼠模型；针刺指标；针刺效应；均值加权分类法评估

*国家重点基础研究发展计划（973计划）资助项目：2012CB518505、2006CB504504、2010CB530500国家自然科学基金委员会资助项目：81360607

#通讯作者：王舒，E-mai1：wangs2008@163.com

脑血管病是神经系统常见病及多发病，目前已成为危害我国中老年人群人身健康和生命的主要原因，其发病率、致残率、死亡率均高，是导致人类死亡的三大疾病之一，给社会和家庭造成严重的经济负担。本病是最广泛应用针灸治疗的适应证之一，其疗效已为针灸界公认。但效应评价指标不一，取穴及手法各异，电针参数不统一，使各个研究的疗效不具可比性，没有形成规范化的治疗方案，而且大样本随机对照实验较少见。为此，本研究以大样本随机对照法为实验原则，以评价针刺指标对大脑中动脉梗死（MCAo）大鼠模型的针刺效应的影响，从而探讨针刺治疗脑梗死的作用机制，为脑梗死针刺治疗方案提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 动物来源及分组 选用体重250～300 g的三级动物（specific pathogen free anima1s，SPF）的成年健康雄性Wister大鼠，由中国医学科学院实验动物中心提供。随机分组：对照组（包括正常组、模型对照组、模型未干预组）和针刺组（包括人中组、尺泽组、内关组、三阴交组、委中组、非穴组）。其中，每个经穴组又分为9个针刺参数组。每组12只，共57组。

1.2 MCAo动物模型的复制及造模成功判定 参照Zea-Longa线拴法[1]复制大脑中动脉缺血模型（midd1e cerebra1 artery occ1usion，MCAo）。大鼠造模清醒后，按Zausinger六分法[2]对其神经功能进行评分，去除评分为4分和5分的动物。

1.3 针刺干预方法 依据《实验针灸学》[3]的常用实验动物针灸穴位定位，选用内关、委中、尺泽、三阴交、人中和非穴等共6个穴位进行提插手法针刺，非穴点取胁下固定点（穴取患侧肋下髂嵴上10 mm的固定点处）作为对照。非穴组：造模成功后待大鼠清醒，选取大鼠患侧（即右侧肢体）胁下处一个非经非穴点针刺，每12小时1次，共干预6次。正常组：不实施造模手术及针刺干预，但也同等条件抓取，同样抓取6次。模型对照组：造模成功后，待大鼠完全清醒，不实施任何针刺，立即给予脑血流量、微循环的测定，之后断头取材（脑组织）测量光镜、梗死率等指标。模型未干组（未针刺组）：造模成功后在相应时间段内，用与针刺组实施同等条件的抓取，但不实施任何针刺干预，共抓取6次。针具用苏州医疗用品厂生产的“华佗牌”毫针，长1.5寸，直径0.32 mm。除对照组外，其余各组干预方法，依据针刺参数的2因素（针刺频率与针刺时间）与3水平（频率的快中慢，即180次/min、120次/min、60次 /min；与时间的短中长，即 5 s、60 s、180 s）的正交设计法，进行神经行为学的研究（针刺参数组合参见表1）。造模成功后待大鼠清醒1 h左右，即给予第1次针刺干预。以后每12小时干预1次，72 h共针刺6次。

表1 九种不同针刺参数组合

1.4 效应指标 MCAo大鼠神经功能评分、软脑膜脑血流及微循环的测定、脑缺血面积（梗死率）的测定、光镜观察的具体方法请参阅本课题的相关研究[4]，在此不再赘述。

1.5 统计方法 采用SPSS17.0计算下的各个经穴的每个测量指标的平均值，以均值加减标准差表示。然后按照平均值加权分类法经穴组的总得分并比较大小。

2 结果

2.1 对照组均值比较 经过均值比较，以正常组、模型对照组、模型未干组等三个组作为分界点或标准是有统计学意义的（除外A/V比值和微血管数各组别的的均值变化不大，所以在此无法做比较）。虽然有些指标如微循环输入枝中的正常组与模型未干组比较P=0.086，大于0.05小于0.1，还是可以接受的，所以用这几个对照组作为标准还是可行的。

2.2 各个指标分类比较 见表2～表10。结果显示，内关穴在降低梗死率、扩张输入枝管径、提高神经行为学评分表现的最突出；委中穴在增加脑血流、提高神经行为学方面表现最佳；尺泽穴在增加脑血流、扩张输出枝管径、提高正常神经细胞数方面表现最好；三阴交在减少坏死神经细胞和噬神经细胞、降低坏死神经细胞率、提高神经行为学评分方面表现最优。说明针刺治疗脑梗死疗效确切，其机制可能是通过改善微循环、增加脑血流量、降低梗死率、降低坏死神经元细胞数、减少噬神经细胞数从而提高神经行为学评分来实现的，为脑梗死的针刺治疗方案提供了理论依据。

表2 梗死比率指标分类比较

由表2可知：在降低梗死率指标上，内关穴最好，其次是委中，再次是尺泽和人中，然后是三阴交，最次的是非穴。

表3 脑血流量分类比较

由表3可知：在增加脑血流指标上，委中、尺泽表现最好，其次是三阴交，再次是内关，然后是人中，最后是非穴。

表4 输入枝（A）分类比较

由表4可知：在微循环输入枝指标中，内关表现最好，其次是委中、尺泽、三阴交，再次就是人中和非穴。

表5 输出枝（V）分类比较

由表5可知：在微循环输出枝指标中，最好的是尺泽，其次是委中和三阴交，再次就是内关、人中和非穴。

表6 正常神经元细胞数分类比较

由表6可知：在光镜-正常神经元细胞数指标中，尺泽最好，其次分别是委中、内关、人中、非穴，最后的是三阴交。

表7 坏死神经元细胞数分类比较

由表7可知：在光镜-坏死神经元细胞数指标中，最好的是三阴交，其次是尺泽、人中，再次是非穴，最后的是内关和委中。

表8 噬神经细胞数分类比较

由表8可知：在光镜-噬神经细胞数指标中，最好的是三阴交，其次是尺泽，再次是人中，然后是内关、非穴，最后的是委中。

表9 坏死神经元细胞率分类比较

由表9可知：在光镜-坏死神经元细胞率指标中，最好的是三阴交，其次是尺泽和人中，再次就是内关、委中、非穴。

表10 神经行为学评分

由表10可知：在神经行为学评分指标中，最好的是内关、委中、三阴交、人中，其次是尺泽，最次的是非穴。

3 讨论

中风病是针刺治疗的首选适应证之一，但是确定最适针刺治疗方案还存在许多不确定因素。正确选穴是取得临床疗效的关键之一，临床上多以“局部选穴，邻近选穴，远端选穴，辨证选穴，随证选穴”为选穴原则[5]。“醒脑开窍”针刺法以内关、人中、三阴交为主穴，其中人中为督脉与手足阳明经脉会穴，可调督脉，开窍启闭，醒脑开窍，宁神定志；内关为八脉交会穴，通阴维脉，有宁心安神、疏通气血之功；三阴交滋补肝肾。该针法治疗中风病，疗效显著，实验研究证实该针法可明显改善患者血液流变学[6]，改善微循环，增加微血管数[4]，增加脑血流量[7]，提高脑缺血模型大鼠缺血脑组织SOD活性，抑制MDA含量[8]，抑制钙离子内流和炎症反应[9]，调节中枢神经递质代谢，促进缺血区侧枝循环的建立[10～11]，改善缺血区软脑膜微血管自律运动紊乱，改善脑灌流[12]，调节脑缺血区能量代谢，减轻兴奋性氨基酸毒性，对抗自由基损伤，减少炎性反应[13]，对缺血后脑细胞有保护作用[14]等。以上实验大多从分子生物学角度出发来研究“醒脑开窍”针法的作用机制，但是效应评价指标不一，取穴及手法各异，电针参数不统一，使各个研究的疗效不具可比性，没有形成规范化的治疗方案，而且大样本随机对照实验研究较少见。为此，本研究以大样本随机对照法为实验原则，以脑梗死大鼠模型为载体，以神经行为学评分、微循环、脑血流量、梗死率、光镜等为测量指标，以均数加权法为数据处理方法，来评价针刺指标对MCAo大鼠模型的针刺效应的影响。研究表明：内关穴在降低梗死率、扩张输入枝管径、提高神经行为学评分表现的最突出；委中穴在增加脑血流、提高神经行为学方面表现最佳；尺泽穴在增加脑血流、扩张输出枝管径、提高正常神经细胞数方面表现最好；三阴交在减少坏死神经细胞和噬神经细胞、降低坏死神经细胞率、提高神经行为学评分方面表现最优。说明针刺治疗脑梗死疗效确切，针刺治疗脑梗死的机制可能是通过改善微循环、增加微血管数、增加脑血流量、降低梗死率、降低坏死神经元细胞数、减少噬神经细胞数从而提高神经行为学评分来实现的，为脑梗死的针刺治疗方案提供理论依据。

另外，从本研究的结果来看，似乎人中穴在脑梗死的针刺治疗中所起的作用不是很大，人中穴在临床与生活中以急救穴抗休克而被大众所知所用。分析原因可能是所选择的针刺测量指标不全，没有针对人中穴的测量指标，所以今后人中穴治疗脑梗死的作用机制也是我们研究的重点。

[1]Longa EZ,Weinstein PR,Car1son S,et a1.Reversib1e midd1e cerebra1 artery occ1usion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91

[2]Zausinger S,Hungerhuber E,Baethmann A,et a1.Neuro1ogica1 impairment in rats after transient midd1e cerebra1 artery occ1usion:A comparative study under various treatment paradigms[J].Brain Res,2000,863(1-2):94-105

[3]Li ZR.Experimenta1 acupuncture science[M].Beijing:China Press of Traditiona1 Chinese Medicine,2003.327

[4]常晓波,王舒,樊小农,等.脑梗死大鼠针刺效应综合评价数学模型的建构[J].天津中医药杂志,2012,29(1):65-68

[5]王启才.针灸治疗学[M].北京:中国中医药出版社,2007.35

[6]韩景献,金炫,刘存志,等.针刺对脑梗死合并高脂血症患者血脂水平的影响[J].中国针灸,2006,26(6):399-402

[7]钱宇斐,樊小农,李雅洁,等.针刺不同穴位对脑缺血模型大鼠脑血流量的影响[J].中国针灸,2009,29(3):213-216

[8]倪光夏,王立,陈道文,等.不同时期针刺对脑梗塞患者疗效、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量影响的比较[J].中医杂志,2004,45(9):668-670

[9]马玉侠,王舒,倪光夏,等.醒脑开窍针刺法对不同时间局灶性脑缺血/再灌注损伤时活体脑片海马神经元Ca2+的影响[J].中医药学报,2007,35(5):9-11

[10]杜元灏,李晶,石磊,等.针刺干预脑梗死侧支循环重建的分子机制研究[J].天津中医药,2009,26(4):298

[11]孙冬玮,杜元灏,石磊,等.电针“水沟”对脑梗死大鼠脑动脉血管细胞内三磷酸肌醇及二酰基甘油含量的影响[J].针刺研究,2008,33(6):392-396

[12]关玲,杜元灏.针刺对局灶性脑梗死大鼠软脑膜微血管自律运动的影响[J].天津中医药,2006,23(3):209-210

[13]赵晓峰,于春泉,郝存江,等.脑缺血模型大鼠脑组织泛素免疫反应性变化及针刺影响[J].天津中医药,2011,28(2):177

[14]马岩璠,王舒,鲁斌,等.醒脑开窍针刺法干预实验性脑梗塞大鼠热休克蛋白基因表达的研究[J].中国针灸,2001,21(2):107-112

Objectives:To eva1uate the inf1uence of acupuncture indexes on the acupuncture effect in the rat mode1s with the midd1e cerebra1 artery occ1usion,by which to pre1iminary exp1ore the mechanism of acupuncture treating cerebra1 infarction,and provides the theoretica1 basis for acupuncture treatment of cerebra1 infarction.Methods:Dup1icated MCAO mode1s by Zea-1onga's thread 1igation assessed by Zausinger's six-point method,and chose rats with 1-3 scores to be grouped.According to the randomized and contro11ed princip1e,rats were divided into basic contro1 groups(inc1uding norma1 group,mode1 contro1 group,mode1 group without intervention)and acupuncture groups[inc1uding Neiguan (PC6)group,Weizhong (BL40)group,Chize (LU5)group,Sanyinjiao (SP6)group,Renzhong(DU6)group and non-acupoint group];in each acupoint or non-acupoint 9 different parameter combinations were respective1y set by orthogona1 intersection method.There were in tota1 60 groups,each group has 12 rats.And the rats were treated by acupuncture with the 1ifting-thrusting manipu1ation every 12 h once,in tota1 6 times.Indexes of neurobehaviora1 scores,cerebra1b1ood f1ow,infarction rate,microcircu1ation,1ight microscope,etc.were measured.In order to eva1uate the inf1uence of acupuncture indexes on the acupuncture effect in rat mode1s with midd1e cerebra1 artery occ1usion(MCAo),on the basis of the add-and-subtract standard deviation of means va1ue from a11 categories in acupuncture group obtained by the app1ication of statistica1 software SPSS17.0,by the norma1 group,mode1 contro1 group,mode1 group without intervention as a reference,a comparison was done;after the c1assified 1eve1s were given the weight coefficients the scores were ca1cu1ated,and then size comparison and sorting were made according to the tota1 scores.Resu1ts:The Neiguan(PC6)group is the most prominent performance in 1owering infarction rate,expanding input branch pipe diameter and improving neurobehaviora1 scores.Weizhong(BL40)group is the best in increasing cerebra1 b1ood f1ow and improving neurobehaviora1 performance.Chize(LU5)group is the best performance in increasing the cerebra1 b1ood f1ow,expanding output branch pipe diameter and increasing the number of norma1 neura1 ce11.Sanyinjiao (SP6)group is the optima1 performance in reducing necrosis of nerve ce11s and neurophags,reducing the necrosis rate of nerve ce11s,and improving neurobehaviora1 scores.Conc1usion:the curative effect of acupuncture treatment for cerebra1 infarction is definite,and its mechanism may be rea1ized through improving microcircu1ation,increasing cerebra1 b1ood f1ow,decreasing the rate of infarction,reducing the number of necrosis of neurons and decreasing the number of neurophags to improve neurobehaviora1 scores,and provide theoretica1 basis for acupuncture treatment for cerebra1 infarction.

Mode1 rats of MCAo,Acupuncture effect,Acupuncture eva1uation,Average weighted c1assified eva1uation

R743.3

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2013.08.001

2013-08-15）