PI-103对人卵巢癌细胞株SKOV3/DDP顺铂化疗效果的影响

刘俊，蔡云朗，任慕兰，吴迪 ，曾娅

(1.东南大学医学院 江苏南京 210009;2.东南大学附属中大医院妇产科，江苏 南京 210009)

卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤，化疗是卵巢癌的重要治疗措施之一。但相当多患者因肿瘤细胞产生药物耐药而导致化疗失败，因此，增强对化疗药物的敏感性是提高卵巢癌治疗效果的有效途径之一。肿瘤细胞产生化疗耐药的共同途径是抑制凋亡，细胞进入凋亡程序的能力直接影响其化疗药物发挥作用的效应。肿瘤细胞抑制进入凋亡程序，进而可以表现出对化疗药物的耐药性，这也是肿瘤细胞的一种自我保护。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋 白 激 酶 B(serine/threonine kinase，Akt;protein kinase B，PKB)/哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路具有调节细胞生长、增殖、迁移，促进细胞周期进程以及参与血管形成等多种功能，是最主要的抑制细胞凋亡的信号途径［1-3］。本研究探讨 PI3K/mTOR双抑制剂 PI-103对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌顺铂耐药细胞株(SKOV3/DDP)细胞顺铂化疗的影响以及可能机制，进一步阐明该通路与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系，为耐药卵巢癌的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SKOV3/DDP(北京市肿瘤医院药物研究所)。一抗:Akt兔抗人多克隆抗体、Phospho-Akt(Ser473)抗体(Bioworld公司)，rps6鼠抗人单克隆抗体、Phosphorps6兔抗人单克隆抗体、Bax兔抗人单克隆抗体、Bcl-2兔抗人单克隆抗体(美国Cell signaling biotechnology公司)，β-actin兔抗人单克隆抗体(Sigma公司);二抗:HRP-标记山羊抗鼠IgG、HRP-标记山羊抗兔IgG(北京康为世纪生物科技有限公司);PI-103(Cayman公司);顺铂(DDP，山东齐鲁制药厂);CCK-8试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所产品;胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI 1640培养基(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SKOV3/DDP细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基，在37℃、5%CO2、相对湿度90%的恒温培养箱中培养，细胞呈贴壁生长。

1.2.2 PI-103与SKOV3/DDP细胞共同培养 取对数生长期SKOV3/DDP细胞消化制成细胞悬液，调整细胞浓度，以1×105ml－1接种于96孔板，培养24 h后，加入 PI-103 的终浓度为 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1，继续培养 24、48、72 h，每个样本设 3个复孔。

1.2.3 PI-103联合DDP与SKOV3/DDP细胞共同培养 两种药物联合作用时，DDP终浓度为0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 及 100.00 μmol·L－1，PI-103 浓度为 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1，每个样本至少设3个复孔，继续孵育72 h。

1.2.4 CCK-8 法测定细胞抑制率 将 1.2.2、1.2.3处理过的96孔板，每孔加20 μl CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2 h，在酶标仪上测定波长为450 nm的吸光度(OD)值，计算细胞抑制率［抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%］。根据各组DDP浓度和抑制率，计算两者的回归系数a、b，代入公式:Y=a+bln X，计算细胞顺铂IC50值。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 实验分组(1)联合用药组:取 PI-103 浓度为 1 μmol·L－1，DDP浓度为 12.5 μg·ml－1(接近于其 DDP IC50值);(2)DDP组:取 DDP 的浓度为 12.5 μg·ml－1;(3)PI-103 组:取 PI-103 的浓度为 1 μmol·l－1;(4)对照组:不加药物处理。

按以上分组处理SKOV3/DDP细胞后均继续培养24 h后消化、收集，制成含1×106ml－1的单细胞悬液1 ml，预冷的PBS冲洗3次，加入1 ml预冷的70%乙醇，4 ℃ 固定 24 h，离心，PBS冲洗，用含有10 μg·ml－1PI和 0.1%RNase A 的 PBS液染色，室温避光30 min后用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.2.6 Western blot检测 SKOV3/DDP 细胞 Akt、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、rpS6、磷酸化的核糖体蛋白S6(p-rpS6)、Bcl-2、Bax及β-actin的表达 分别以PI-103、DDP及PI-103、DDP联合作用于SKOV3/DDP细胞24 h后，每瓶细胞使用400 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解缓冲液抽提细胞总蛋白。40 μg蛋白经聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后转移至PVDF膜，室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，用含0.05%Tween 20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次，每次10 min;加入相应的碱磷酶标记的二抗(1∶5 000)，室温1 h，ECL显影、定影、曝光，结果采用Image J软件进行灰度分析。以β-actin作为上样内参，目的蛋白条带灰度与内参条带灰度的比值作为各组实验数据。每个样本至少重复3次，取平均值。

1.3 统计学处理

4月26日在奔赴阿斯特拉罕途中第三个点即是扎木扬村，在扎木扬渡口渡过伏尔加河，就可以来到建于19世纪的和硕特庙(Хошеутовский хурул)。

2 结 果

2.1 PI-103对SKOV3/DDP细胞生长的影响

见图1。

图1 PI-103对卵巢癌SKOV3/DDP细胞生长抑制率的影响Fig 1 The effect of PI-103 on inhibition rate in SKOV3/DDP cell lines

PI-103能够抑制SKOV3/DDP细胞的增殖，随着PI-103 浓度的增加(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1)，细胞生长抑制率逐渐增加(P ＜0.001)，而且随着药物作用时间(24、48、72 h)的延长，细胞的生长抑制作用也明显增加(P＜0.001)。

2.2 不同浓度PI-103对SKOV3/DDP细胞顺铂化疗的影响

见表1。

表1 PI-103与DDP联用对SKOV3/DDP细胞生长的抑制率的影响(± s，n=3)Tab 1 The effect of PI-103 combined with DDP on inbibition rate in SKOV3/DDP cell lines± s，n=3)

表1 PI-103与DDP联用对SKOV3/DDP细胞生长的抑制率的影响(± s，n=3)Tab 1 The effect of PI-103 combined with DDP on inbibition rate in SKOV3/DDP cell lines± s，n=3)

与对照组比较，a P ＜0.05

DDP/μg·mol－1 对照组PI-103 浓度/μmol·L－1 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 F 值 P值0.78 11.53 ±2.11 16.29 ±1.55a 20.46 ±0.06a 25.47 ±1.07a 30.66 ±0.41a 34.33 ±0.41a 136.082 ＜0.001 1.56 14.97 ±2.87 21.87 ±2.84 27.72 ±3.53a 24.36 ±1.03a 42.81 ±1.64a 44.78 ±3.61a 38.763 ＜0.001 3.13 23.49 ±5.19 25.32 ±3.84 36.05 ±2.09a 40.55 ±2.49a 49.12 ±6.32a 51.78 ±4.13a 22.876 ＜0.001 6.25 34.35 ±3.78 37.26 ±1.66 43.31 ±3.15 47.19 ±4.67a 56.94 ±5.58a 61.61 ±2.84a 23.742 ＜0.001 12.5 45.00 ±2.09 44.83 ±1.63 47.78 ±1.32 54.30 ±4.43a 59.39 ±2.26a 62.06 ±1.21a 28.752 ＜0.001 25 60.13 ±1.66 61.71 ±7.23 60.11 ±4.60 64.97 ±2.52 72.40 ±1.72a 75.07 ±1.30a 8.734 0.001 50 69.56 ±4.78 71.32 ±6.70 71.11 ±6.25 72.23 ±6.61 77.77 ±2.45 79.44 ±1.26 1.881 0.171 100 84.33 ±1.28 85.20 ±2.76 84.93 ±1.84 85.69 ±2.71 85.80 ±1.82 86.07 ±2.450.267 0.928

当 DDP 浓度为 0.78 μg·ml－1时，各实验组SKOV3/DDP细胞抑制率与对照组相比差异均有统计学意义(P ＜0.001)。当 DDP 浓度为 1.56 或 3.13 μg·ml－1，与浓度分别为 0.5、1.0、2.0、4.0 μmol的 PI-103共培养时，SKOV3/DDP细胞抑制率与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.001)。当DDP浓度为6.25或 12.5 μg·ml－1，与浓度分别 1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的PI-103共培养时，SKOV3/DDP细胞抑制率与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.001)。当DDP 浓 度 为 25 μg· ml－1，与 浓 度 分 别 为 2.0、4.0 μmol·L－1的 PI-103 共培养时，SKOV3/DDP 细胞抑制率与对照组比较差异均有统计学意义(P=0.001)。可以看出，PI-103联合DDP给药比单用顺铂对SKOV3/DDP细胞生长抑制作用更明显。

以浓度分别为 0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的PI-103作用于SKOV3/DDP细胞72 h，顺铂IC50值分别为(13.96 ±1.20)、(12.24 ±1.77)、(9.73 ±1.50)、(6.94 ±1.46)、(3.78 ±0.99)及(2.83 ±0.54)μg·ml－1。其中 PI-103 浓度为 0.25μmol·L－1时，顺铂IC50值与对照组比较，差异无统计学意义，其他浓度PI-103作用下顺铂IC50值与对照组比较，其差异有统计学意义(F=35.865，P ＜0.001)。

实验组与对照组比较，SKOV3/DDP细胞经0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的 PI-103 作用后对顺铂敏感性分别增加了 12.30%、30.28%、50.30%、72.96%、79.69%。

2.3 单药及两药联合对细胞凋亡率的影响

见图2。

图2 PI-103、DDP单药及联合用药对SKOV3/DDP细胞凋亡的影响(a P ＜0.001)Fig 2 The effect of PI-103 and DDP alone and in combination on the apoptosis of SKOV3/DDP cell lines(a P ＜0.001)

PI-103、DDP及两药联合作用SKOV3/DDP细胞24 h后，FCM检测其细胞凋亡的变化，PI-103联合顺铂引起的细胞凋亡改变均明显高于单独用药组，差异有统计学意义(P＜0.001)。

2.4 PI-103、DDP 对 SKOV3/DDP 细胞中 Akt、PAkt、rpS6及P-rpS6表达的影响

见图3。

图3 PI-103、DDP单药及联合用药材SKOV3/DDP细胞Akt、p-Akt、rpS6、p-rpS6表达的影响Fig 3 The effect of PI-103 and DDP alone and in combination on the expression of Akt，p-Akt，rpS6，p-rpS6 in SKOV3/DDP cell lines

在SKOV3/DDP细胞中，使用PI-103能够显著降低细胞中p-AKT、p-rpS6蛋白的表达(P＜0.001);各组间Akt、rpS6蛋白表达两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05);DDP组与对照组比较，各蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05);联合用药组与PI-103比较，P-Akt蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.001)，其余蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.5 PI-103、DDP对SKOV3/DDP细胞中凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2表达的影响

见图4。

在SKOV3/DDP细胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2在对照组细胞中表达量很高，促凋亡蛋白Bax表达量相对较低。以1 μmol·L－1的 PI-103 处理 SKOV3/DDP 细胞24 h，对Bcl-2和 Bax的表达几乎没有影响(P＞0.05);以 12.5 μg·ml－1的 DDP 作用于 SKOV3/DDP细胞24 h，Bcl-2表达下调，Bax达上调;而PI-103与DDP联合作用24 h，Bcl-2表达量进一步下调，Bax表达量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图4 PI-103、DDP单药及联合用药对SKOV3/DDP细胞Bcl-2、Bax表达的影响Fig 4 The effect of PI-103 and DDP alone and incombination on the expression of bcl-2，bax，in SKOV3/DDP cell lines

3 讨 论

目前，铂类化合物仍是卵巢癌化疗的一线药物，然而铂类耐药也是影响卵巢癌化疗效果的主要原因。细胞凋亡是顺铂敏感性的决定性因素，PI3K/Akt/mTOR信号转导通路是重要的抑制凋亡的途径。相关文献表明，该通路与卵巢癌［4］、大肠癌［5］等多种肿瘤的化疗耐药相关，一些研究［4-6］表明，肿瘤细胞中 Akt、mTOR的过表达或磷酸化水平上调与顺铂耐药有关，而PI3K抑制剂或mTOR抑制剂能增加顺铂敏感性，其机制可能为:活化状态的Akt直接使BAD磷酸化，从而使抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL活化抑制细胞凋亡;也抑制线粒体中细胞色素C的释放，维持线粒体的完整性从而抑制细胞死亡;也能磷酸化FOXO转录因子调控肿瘤细胞周期进程;还可抑制Bim的磷酸化，影响促凋亡系统的激活，且rp-S6蛋白的磷酸化参与调控促凋亡与抑凋亡系统的mRNA的翻译如Mcl-1等［2］。Peng等［7］发现，Akt/mTOR通路的激活可以抑制DDP诱导卵巢癌细胞的凋亡作用，引起卵巢癌细胞产生DDP耐药。将RAD001与DNA损伤诱导剂(如DDP)结合，可以通过调控mTOR通路增强肿瘤细胞对于DDP诱导凋亡的敏感性［8］。但也有研究［9］表明，单用 mTOR抑制剂可能反馈性上调了P-AKT(Ser473)，导致其作用减弱。Mazzoletti等将mTOR抑制剂和PI3K/mTOR双抑制剂PI-103联合应用于人卵巢癌细胞与前列腺癌细胞，发现PI-103可以阻止由mTOR抑制剂反馈性激活PI3K/Akt途径，更大程度地抑制AKT磷酸化，最终明显减少癌细胞的生长、增殖、侵袭、转移［10］。也有体外实验表明，PI-103还能提高紫杉醇、长春新碱、阿霉素等化疗药物抗肿瘤效果［11］。PI-103是一种能同时抑制P13K/mTOR的双抑制剂，尤其作用于PI3Kα、mTORC1及mTORC2，也作用于70个其他激酶包括Ⅱ、Ⅲ类PI3Ks的多种代表性蛋白激酶，而且PI-103有良好的药物稳定性、毒副作用小。本研究通过应用PI-103对卵巢癌耐药株SKOV3/DDP的抗癌活性及其对顺铂化疗作用的探究，进一步阐述了PI3K/Akt/mTOR信号转导通路与卵巢癌化疗耐药的关系，为改善卵巢癌化疗耐药提供理论依据。

本研究结果表明，PI-103对卵巢癌SKOV3/DDP细胞有明显生长抑制作用，且具有浓度、时间依赖性，增加DDP对细胞生长的抑制作用，说明PI-103在卵巢癌中有抗癌活性，且能提高顺铂化疗敏感性。本研究结果显示，PI-103能明显下调PI3K、mTOR的下游重要靶蛋白Akt、rp-S6的磷酸化水平，尤其是PI-103与DDP联合作用时，能更大程度地抑制磷酸化Akt的表达;而当 DDP 单独作用时，Akt、p-Akt、rpS6、p-rpS6蛋白的表达几乎无改变。同时，本研究也观察到，PI-103单独作用时凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达几乎无变化，而DDP单独作用时能使Bcl-2表达下调，Bax达上调，且联合PI-103作用时促凋亡蛋白Bax的表达量进一步上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显下调，这说明PI-103可以增加顺铂对凋亡相关蛋白表达的调控，促进SKOV3/DDP细胞的凋亡，最终表现为促进顺铂敏感性。PI-103明显提高顺铂对SKOV3/DDP细胞生长的抑制作用，且能增强顺铂诱导的细胞凋亡效应，提示PI3K/Akt/mTOR信号通路传导的阻滞可以提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

综上所述，PI3K/mTOR双抑制剂PI-103能够提高卵巢癌耐顺铂细胞株对顺铂的敏感性，且这种作用主要源于PI-103阻断了PI3K/Akt/mTOR通路信号传导，增加DDP对细胞生长的抑制作用，且加强顺铂对Bax与Bcl-2表达的调控及促凋亡作用，最终增强卵巢癌化疗效果，为逆转卵巢癌化疗耐药提供新的契机，因此，PI3K/mTOR双抑制剂PI-103有望成为逆转化疗耐药的靶向性药物。

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