miRNA-21在激素非依赖前列腺癌细胞系PC3中的表达及对其增殖和侵袭性影响

苏雷，李文思，肖黎，秦盛斐，佟明

(辽宁医学院附属第一医院泌尿外科，辽宁锦州 121001)

前列腺癌已成为影响我国男性尤其是50岁以上男性健康的一个重要因素，向激素非依赖的转化是前列腺癌进展中最为恶性的事件，它使得疾病几乎不可治愈［1］。治疗雄性激素非依赖性前列腺癌在目前来说仍然是一个临床难题，这使得改变治疗方式非常急迫。自从2005年在高度恶性的胶质母细胞瘤中发现miRNA-21是一种凋亡抑制因子以来，对于它的关注度就一直未减［2］。更引人注目的是，1年以后miRNA-21在6种实体肿瘤中均被发现是一种唯一的上调因子，这6种肿瘤中包括前列腺癌［3］。本实验通过观察激素非依赖前列腺癌细胞系PC3在转染miRNA-21抑制剂后miRNA-21的表达情况，探讨miRNA-21对PC3增殖及侵袭性影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人前列腺癌细胞株PC3细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心);RPMI 1640培养基(Gibco公司);活性炭葡聚糖处理的胎牛血清(Biowest公司);Lipo2000转染试剂(Invitrogen公司);miRNA-21抑制剂(广州锐博公司);TR-PCR试剂盒(Takara公司);CCK-8反应液(江苏碧云天公司);Transwell细胞培养(Chemicon公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 人前列腺癌细胞株PC3置RPMI 1640完全培养基中(不含抗生素)，37℃、5%CO2饱和湿度下培养箱内培养，隔日换液1次，细胞平铺培养瓶底超过85%时进行传代。转染前1 d铺96孔板，次日将miRNA-21抑制剂按转染试剂盒操作说明进行转染。

1.2.2 RT-PCR检测miRNA-21的表达 将转染后的人前列腺癌细胞株PC-3(转染组)接种于96孔板完全培养基中，并且铺满约90%。设置未加miRNA-21抑制剂转染组为空白对照组，孵育48 h后，Trizol法提取细胞总RNA后用miRNA提取试剂盒提取miRNA，反转录合成cDNA，配置PCR反应液扩增后，取10～20 μl点样在浓度为 2% 的琼脂糖凝胶上(含 0.5 μg·ml－1溴化乙锭)，0.5 μl TAE 作为电泳缓冲液，以160 V电压进行电泳，30 min停止电泳。紫外透射仪观察电泳结果并摄取图像，应用GSG2002核酸/蛋白质凝胶图像分析管理系统进行灰度值测定，以每一样品与其内参β-actin的比值代表该样品miRNA-21的相对含量。

1.2.3 CCK-8检测转染后细胞增殖 将转染后的人前列腺癌细胞株PC-3接种于96孔板完全培养基中，并且铺满约90%，转染组与空白对照组分别孵育24、48、72 h。已接种好细胞的孔板每孔中加10 μl CCK-8检测液和100 μl完全培养液，孵育2 h后放入酶标仪中检测，以450 nm吸光度值进行读数并记录数值。

1.2.4 Transwell小室结合CCK-8检测细胞侵袭力取24孔0.8 μm的Tanswell细胞培养板(上室内已铺好基质胶)，按Chemicon公司的说明要求，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置20 min，使基质胶水化，再吸除培养基，将转染组与空白对照组的PC3细胞经胰酶消化后，以 2×103ml－1接种于Transwell细胞培养板上室，待细胞贴壁后，更换上室内培养基为无血清培养基。下室用胎牛血清培养基，培养36 h，除去上室内细胞，用CCK-8法间接检测小室培养板下室的细胞吸光度即代表穿过基质胶及聚碳酸酯膜细胞的数量，对比穿过细胞数量即代表侵袭力变化。

1.3 统计学处理

所有资料均采用SPSS18.0统计软件进行数据分析。在符合正态性和方差齐性的前提下，以±s进行统计学描述;统计推断则采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA-21的相对含量

RT PCR检测显示，miRNA-21相对表达量空白对照组为0.50 ±0.02，转染组为 0.34 ±0.01，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)，表示经过转染能成功抑制miRNA-21在PC3中的表达(图1)。

图1 对照组与转染组miRNA-21的相对表达量PC3.The control group;PC3-IN.Transfection groupFig 1 Relative expression of micrornas-21 in control group and transfection group

2.2 CCK-8检测细胞增殖

见表1。

72 h增殖分析结果显示，转染组与空白对照组细胞增殖情况差异有统计学意义(24 h:t=2.792，P＜0.05;48 h:t=16.067，P ＜0.01;72 h:t=19.902，P ＜0.01)，表明抑制miRNA-21的表达后PC3细胞的增殖能力明显降低。

表1 CCK-8检测PC3细胞吸光值(A)(x±s)Tab 1 CCK 8 testing PC3 cells absorb light values(A)(x±s)

2.3 Transwell小室结合CCK-8法检测细胞侵袭力

CCK-8法检测吸光度结果表明，转染组吸光度值为0.28 ±0.04，空白对照组吸光度值为 0.63 ±0.06，两组差异具有统计学意义(P＜0.01)，表明抑制miRNA-21的表达后PC3细胞的侵袭力降低。

3 讨 论

miRNA是真核生物中一种约22～24个核苷酸大小、参与转录后基因调控的非编码单链小分子RNA。它可特异性的识别靶mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)并与之结合，引起靶mRNA的降解或翻译抑制，进而对基因进行转录后的表达调控，调节许多重要的细胞生物学行为［4］。在过去的短短几年中，在大样本癌症人群中对miRNA已经进行了广泛的研究，普遍采用的方法是基因杂交，或基于PCR的技术手段，包括寡核苷酸微矩阵研究，基于免疫磁珠的流式细胞仪检测以及qRT-PCR等。在众多的癌症中，miRNA-21表现出过度的表达(如前列腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌等)。尽管对于miRNA-21是不是原癌基因或者miRNA-21在癌症中是否起到关键性的作用还存在较大的争议，但是miRNA-21已经是众多miRNA中最受关注和研究的最为深入的miRNA之一。Lu等［5］在对各种实体肿瘤和其对应的正常组织的miRNA大规模的筛查中发现，miRNA-21在PC-3中的表达水平较其他肿瘤细胞，如 HEL、TF-1、293、MCF-7 和 SKMEL-5 等显著增高。这项研究提示，我们miRNA的资料具有高度的信息价值，并且关系到肿瘤发生中的不同谱系和不同阶段。另外，这一结果与 Chan 等［6］和 O'donnrl等［7］发表的文献结果相同。高水平miRNA-21的单一表达能有效地对付去势的拮抗作用。更重要的是，RT-PCR分析显示，miRNA-21在PCa中的表达远远高于其邻近正常组织。这些结果都说明miRNA-21能促进PCa的病理发生过程并且可作为癌症侵袭的标志［8］。

本实验通过转染miRNA-21抑制剂，直接抑制了人前列腺癌细胞株PC3中miRNA-21的表达。在成功抑制miRNA-21的表达后通过CCK-8法测得转染组细胞增殖能力减弱，证明了miRNA-21的低表达可降低细胞增殖能力。但细胞的增殖能力并不能反映其侵袭能力，而Transwell小室的构建(使得肿瘤细胞要向下室内迁移，则必须突破的基质胶方能进入下室)能较好地反映其侵袭性，且采用CCK-8法间接测量比传统光镜下多视野直接计数法更为准确。实验中转染组的侵袭性较空白对照组的侵袭性明显减弱(P＜0.01)，说明抑制miRNA-21的表达后，PC3细胞侵袭能力减弱。因此，抑制miRNA-21在非激素依赖性前列腺癌细胞PC3中的高表达能减弱其增殖及侵袭能力，为进一步进行体内肿瘤细胞侵袭能力的研究奠定了基础，并可能通过调节miRNA-21的表达来抑制肿瘤的增殖及侵袭能力。

我们考虑miRNA-21在体内可能通过诱导G1期的细胞进入细胞周期，促使雄性激素依赖的细胞生长。通过反义锁定寡核苷酸或者是拮抗剂减少非雄性激素依赖的PC3的集落形成和肿瘤的发生。miRNA-21在前列腺癌细胞的过度表达，降低了双氢睾酮的含量，引起PSA的上调，增强了非雄性激素依赖性的增长。提示miRNA-21有可能控制了关键因子在非依赖性前列腺癌细胞PC3的表达，这些关键因子和维持雄性激素耐受性疾病的发生有关。这个发现为我们进一步研究雄性激素非依赖性前列腺癌提供了理论价值。

［1］GANDELLINI P，FOLINI M，ZAFFARONI N，et al.Towards the definition of prostate cancer-related microRNAs:where are we now［J］.Trends Mol Med，2009，15(9):381-390.

［2］CHAN J A，KRICHEVSKY A M，KOSIK K S.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res，2011，65(14):6029-6033.

［3］VOLINIA S，CALIN G A，LIU C G，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.ProcNatl Acad Sci USA，2010，103(7):2257-2261.

［4］CHEN C Z，LI L，LODISH H F，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differenti-ation［J］.Science，2010，303(5654):83-86.

［5］LU J，GETZ G，MISKA EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435:834-838.

［6］CHAN J A，KRICHEVSKY A M，KOSIK K S.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res，2008，65:6029-6033.

［7］O'DONNELL K A，WENTZEL E A，ZELLER K I，et al.c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression［J］.Nature，2007，435:839-843.

［8］RIBAS J，NI X，HAFFNER M，et al.miRNA-21:an androgen receptor regulated microRNA that promotes hormone-dependent and hormone-independent prostate cancer growth［J］.Cancer Res，2009，69(18):7165-7169.