BTG1在HK-2和786-O细胞株中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响

2013-09-03 01:50刘春辉许斌张磊卢凯陈恕求陈明
东南大学学报(医学版) 2013年5期
关键词:肾癌细胞株细胞周期

刘春辉,许斌,2,张磊,卢凯,陈恕求,2,陈明,2

(1.东南大学医学院,江苏南京 210009;2.东南大学附属中大医院泌尿外科,江苏 南京 210009)

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,占肾脏恶性肿瘤的90%,是泌尿系统常见的恶性肿瘤,其中约85%为肾透明细胞癌[1]。B细胞易位基因 1(B-cell translocation gene 1,BTG1)属于BTG/TOB家族。研究表明,该家族的所有成员都具有抗增殖活性[2]。但BTG1在肾细胞癌发生、发展中的作用尚不明确。我们前期实验发现,BTG1在肾透明细胞癌组织中低表达[3]。本研究进一步通过 Western blotting方法检测BTG1蛋白在人肾小管上皮细胞株(HK-2)、肾透明细胞癌细胞株(786-O)中的表达,并构建BTG1表达质粒转染786-O,合成BTG1干扰RNA转染HK-2,通过流式细胞仪(FACS)观察BTG1对HK-2、786-O细胞株周期和凋亡的影响,进一步明确BTG1在肾细胞癌中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 HK-2购自上海生命科学研究院细胞库,786-O购自中国科学院基础医学研究所。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人 BTG1抗体购自 Abcam(Hong Kong)公司,兔抗人 GAPDH抗体购自 Santa Cruz公司,辣根过氧化酶标记的二抗(山羊抗鼠、山羊抗兔)购自北京中杉金桥生物技术有限公司,PVDF膜购自Millipore公司,细胞周期试剂盒购自联科生物公司,AnnexinⅤ-FITC、PI凋亡试剂盒购自UBio公司,Lipofectamin 2000转染试剂购自Invitrogen公司,pcineo质粒由南京医科大学公共卫生实验室惠赠,Top 10感受态细胞为本实验室自行保存,ECORⅠ、Mlu 1内切酶,T4连接酶购自Takara公司,ECL发光试剂购自碧云天公司,高纯度质粒中量小提试剂盒购自天根生化科技有限公司,胎牛血清购自HyClone公司,RPMI1640、DMEM培养基购自Gibco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 以含10%胎牛血清的完全培养基在37℃、5%CO2、95%饱和湿度的细胞培养箱中培养,以0.25%的胰蛋白酶消化细胞,每周传代2~3次。

1.2.2 BTG1表达质粒的构建 实验方法参见文献[3]。

1.2.3 BTG1抑制剂(BTG1-siRNA)合成 实验方法参见文献[3]。

1.2.4 细胞瞬时转染 实验方法参见文献[3]。质粒用量为 3 μg,RNA 为 200 pmol。

1.2.5 Western blotting检测BTG1蛋白表达 实验方法参见文献[3],以GAPHD作为内参。

1.2.6 FACS检测细胞周期 细胞转染72 h后收集细胞,以75%乙醇固定,-20℃保存24 h后,以1 000 r·min-1离心 5 min,弃上清,加入 3 ml PBS,弹松细胞,静置15 min,离心后弃上清。加入1 ml细胞周期固定液,震荡5 s,静置30 min后送检。

1.2.7 FACS检测细胞凋亡 细胞转染72 h后收集细胞。PBS轻洗细胞2次,加入500 μl×binding buffer重悬细胞。细胞悬液中加入5 μl AnnexinⅤ-FITC试剂,混匀后4℃避光孵育15 min,加入10 μl PI,轻轻混匀,4℃避光孵育5 min,1 h内送检。

1.3 统计学处理

每组实验重复3次,数据采用IPSS13.0软件处理。组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Western blotting检测BTG1蛋白的表达

见图 1、2。

图1 BTG1蛋白在HK-2及786-O中的表达Fig 1 The expression of BTG1 protein in HK-2 and 786-O

图1显示,BTG1蛋白在HK-2细胞中的表达高于在786-O细胞中的表达。

图2 细胞转染后BTG1蛋白的表达Fig 2 The expression of BTG1 protein after transfection

图2显示,与空白对照相比,HK-2细胞转染BTG1抑制剂后,BTG1蛋白表达量下降。786-O细胞转染BTG1表达质粒后,BTG1蛋白表达量增高。

2.2 BTG1蛋白高表达对786-O细胞凋亡的影响

见表1、图3。

表1 786-O转染BTG1表达质粒及空白对照后细胞凋亡比率 %Tab 1 The ratio of cell apoptosis after 786-O transfected of BTG1 expression plasmid and negative control%

图3 786-O转染BTG1表达质粒后细胞凋亡流式图Fig 3 The chart of cell apoptosis after 786-O transfected of BTG1expression plasmid and negative control examined by FACS

表1、图3显示,与空白对照比较,786-O细胞转染BTG1表达质粒后,细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率均增加(均P<0.01)。

2.3 BTG1蛋白低表达对HK-2细胞凋亡的影响

见表2、图 4。

表2 HK-2转染BTG1抑制剂及空白对照后细胞凋亡比率 %Tab 2 The ratio of cell apoptosis after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control %

图4 HK-2转染BTG1抑制剂后细胞凋亡流式图Fig 4 The chart of cell apoptosis after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control examined by FACS

表2、图4显示,与空白对照相比,HK-2转染BTG1抑制剂后,细胞早期凋亡率下降(P<0.01),晚期凋亡率及总凋亡率减少,但差异无统计学意义。

2.4 BTG1对786-O细胞周期的影响

见图 5、6。

图5 786-O转染BTG1表达质粒后细胞周期柱形图Fig 5 The column chart of cell cycle after 786-O transfected BTG1 expression plasmid and negative control

图6 786-O转染BTG1表达质粒后细胞周期流式图Fig 6 The chart of cell cycle after 786-O transfected BTG1 expression plasmid and negative control

图5、6显示,与空白对照相比,786-O细胞转染BTG1表达质粒后使G0/G1期细胞增多(分别为41.18% ± 1.03% 与 30.78% ± 0.93%,P < 0.01),S期细胞减少(分别为43.07% ±2.35%与56.43% ±2.14%,P <0.05)。G2/M 期细胞在两组间差异无统计学意义。

2.5 BTG1对HK-2细胞周期的影响

见图 7、8。

图7 HK-2转染BTG1抑制剂后细胞周期柱形图Fig 7 The column chart of cell cycle after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control

图7、8显示,HK-2细胞中转染BTG1抑制剂后,G0/G1期细胞减少(分别为 34.64% ±0.88%与51.17% ±1.84%,P <0.01),S 期细胞增多(分别为58.70% ±1.17%与 32.33% ±0.23%,P <0.01),G2/M期细胞增多(分别为6.33% ±1.44%与16.49% ±2.07%,P <0.01)。

3 讨 论

肾癌是世界上十大常见肿瘤之一,2012年美国肾癌新发病人64 770人,死亡患者13 570人,较2011年均有所增加[4]。虽然技术的进步,尤其是影像技术的进步,使得肾癌能够更早的发现,但是仍然有20% ~30%的患者被发现时肿瘤已经出现了转移[5],并且约有20%接受手术的患者在手术后会出现复发和转移[6]。所以,明确肾癌的发病原因,为寻找有力的治疗方案提供理论支持一直是国内外研究的热点。本实验以明确BTG1基因对HK-2及786-O细胞周期及细胞凋亡的影响为主要研究目的。

图8 HK-2转染BTG1抑制剂后细胞周期流式图Fig 8 The chart of cell cycle after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control examined by FACS

BTG1属于BTG/TOB家族,最早发现于淋巴细胞白血病。BTG1基因位于12q22染色体,mRNA全长1.8 kb,在G0/G1期细胞中高表达,在S/M期细胞中低表达。BTG/TOB家族由6编码蛋白的分子质量为19 kD,在 G0/G1期细种抗增殖蛋白组成(BTG1、BTG2/PC3/Tis21、 BTG3/Ana、 BTG4/PC3B、 TOB/TOB1、TOB2),其主要结构特征是在N'端有104~106个高度同源性的氨基酸,这个同源区域包括两个保守的同源区A盒和B盒[7]。A盒主要有抗增殖作用,B盒主要有与靶分子结合的功能[8]。

研究发现,BTG1能够抑制NIH3T3细胞[9]和骨细胞[10]的增殖,促进乳腺癌[11]及 MCF-7 细胞[12]的凋亡。在本研究中,我们观察到高表达BTG1能够促进786-O细胞凋亡,低表达BTG1能够抑制HK-2细胞凋亡。但是BTG1的具体作用途径尚不明了。已有研究表明,BTG1的促凋亡作用可能与P53介导的NF-κB的调控有关。也有研究表明可能是BTG1参与了DNA的甲基化,进而诱导了细胞的凋亡。Nahta等[13]则证明,BTG1通过Bcl-2的负调控诱导乳腺癌细胞的凋亡。BTG1还通过与JAK/STAT1中的LPS、IFN-γ作用促进肿瘤细胞的凋亡[14]。

肿瘤的增长与细胞的增殖密切相关。研究发现,BTG2和TOB1的抗增殖作用是通过其与Caf1a/Caf1b脱腺苷酶的相互作用实现的[12]。而细胞的增殖也与细胞分裂速度、凋亡等有着密切的关系。细胞分裂速度减慢将明显降低肿瘤的生长速度。我们的研究表明,BTG1能够将细胞阻滞在G0/G1期,阻止细胞的分裂。

综上所述,我们发现 BTG1能够调节786-O及HK-2细胞的凋亡及细胞周期。可能通过这两方面,影响细胞增殖等生物行为。但其具体机制仍需要我们进一步研究。同时,BTG1的具体作用途径尚不明了,需要我们进一步明确。

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