人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定

陈晓鹏，杨来志，葛国朝，崔巍，屠佳，田野

(皖南医学院弋矶山医院肝胆一科，安徽芜湖 241001)

乙酰肝素酶(也称类肝素酶，heparanase，HPSE)是一种糖苷内切酶，它通过降解细胞外基质硫酸乙酰肝素蛋白多糖，在肿瘤转移及血管生成等病理过中发挥重要作用，并在多数恶性肿瘤细胞高水平表达［1-2］。故深入研究HPSE基因的转录调控机制，对于合理调节其表达水平、探讨肿瘤生物治疗的新方法具有重要意义［3］。我们前期在克隆HPSE启动子核心片段的基础上分析发现，该启动子虽可驱动下游基因在肿瘤细胞特异性表达，但活性较低［4-5］。本研究我们拟对HPSE基因启动子上、下游邻近序列进行分段扩增，并分别分析其促转录活性，为进一步筛选、鉴定其增强子序列奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、细胞和仪器

DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、PFX、dNTP、PCR Buffers(Takara 公司);PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒(北京道普公司);无内毒素质粒大提试剂盒(北京天能生物技术有限公司);T4 DNA ligase、限制性内切酶KpnⅠ、SalⅠ、大肠杆菌DH5a感受态细胞、pEGFP-N1质粒和各种引物(上海生工生物公司合成);胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂(英国Oxoid公司);Lipofectamne 2000、DMEM培养基和RPIM-1640培养基(GIBCO公司)。人肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901(上海中科院细胞库)。PCR扩增仪(BIORAD公司)，二氧化碳培养箱(Thermo Forma公司)，倒置显微镜(OLYMPUS公司);荧光显微镜(Nikon公司);FC500MPL流式细胞仪(Backman公司)。

1.2 候选序列的确定

根据HPSE之DNA序列，设计选取10个片段作为增强子候选序列(enhx，x分别为1，2……10)，其中启动子上游6段，启动子下游4段，每个片段共1 200 bp，为避免相邻片段之间将增强子序列截为两个部分，在两相邻片段之间重叠200 bp。

1.3 重组质粒的构建与鉴定

改造载体 PEGFP-N1中的 VspⅠ位点，增加KpnⅠ、SalⅠ酶切位点，退火引物为taatGGCGCGCCaa tcgaaGGTACCgacaaACGCGTatccgaGTCGACat和taatGTC GACtcggatACGCGTttgtcGGTACCttcgattGGCGCGCCat，改造的质粒命名为pEGFP-MU，作为本研究的阴性对照载体。化学方法合成猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)增强子序列，全长237 bp。测序鉴定SV40增强子序列合成正确，设计引物，PCR扩增，并增加酶切位点(12 bp)，其中上游KpnⅠ酶切位点GGTACC，下游SalⅠ酶切位点GTCGAC，引物由上海生物工程有限公司合成。反应体系 50 μl，反应条件:95℃预变性5 min，94 ℃ 55 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共35 个循环，最后72℃延伸10 min;将扩增的片段插入到质粒pEGFP-MU的KpnⅠ和SalⅠ两酶切位点之间，构建载体pEGFP-MU-SV40e;将连接反应液转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性菌落、提取质粒DNA，分别双酶切和PCR扩增、测序鉴定，正确者作为本实验的阳性对照载体。根据HPSE之DNA序列设计引物，从人血基因组中PCR扩增上述候选增强子序列1～10，并增加上述酶切位点，上游Kpn I位点后面序列分别与候选增强子enhx序列5'端吻合，下游SalⅠ位点后面序列分别与enhx序列3'端互补，预计enh6扩增序列长度为1 092 bp(包括完整的序列1 080 bp和酶切位点12 bp)，其余片段扩增序列长度为1 212 bp(包括完整的候选增强子序列1 200 bp和酶切位点12 bp)。同法构建实验载体pEGFP-MU-enhx并鉴定。

1.4 质粒转染和功能分析

人肿瘤细胞株BEL-7402、SGC-7901常规方法复苏、传代、冻存和培养。提取质粒，选取生长状态良好、处于对数生长期的细胞，待融合度达80%调整细胞计数，使用6孔板铺板，细胞转染按照Lipofectamine 2000说明书操作。在37℃的CO2培养箱中孵育细胞40 h。贴壁细胞用0.25%的胰酶消化后，用含血清培养基终止消化。所有转染条件相同，转染时间为48 h，然后进行荧光显微镜下观察和流式细胞分析，检测荧光强度和转染效率。实验重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1 对照质粒的构建和鉴定

SV40增强子PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳显示，扩增条带(长度为249 bp，包括SV40增强子的完整序列和酶切位点12 bp)与预期的SV40增强子237 bp片段基本符合，条带清晰。构建的pEGFP-MU-SV40e载体行KpnⅠ和SalⅠ双酶切电泳可见2个片段，单一酶切均仅有1个片段，初步证明载体构建正确。以pEGFP-MU-SV40e重组质粒为模板，可扩增出长为SV40增强子序列片段，测序结果包含完整的SV40增强子序列，与GenBank一致。对比一致是从33 bp处至269 bp处，长度为237 bp。从 27～32 bp处为GGTACC是KpnⅠ酶切位点，从270～275 bp处为GTCGAC是SalⅠ酶切位点(图1)。

图1 SV40增强子PCR产物部分测序图Fig 1 Partial sequencing graph of PCR product of SV40 enhancer

2.2 实验载体pEGFP-MU-enhx的构建和鉴定

10个候选序列PCR产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳显示，扩增条带与预期长度1 200 bp片段符合。构建的pEGFP-MU-enhx载体行KpnⅠ和SalⅠ双酶切电泳可见2个片段，单一酶切均仅有1个片段，初步证明载体构建正确。以pEGFP-MU-enhx重组质粒为模板，可扩增出长为1 200 bp左右的候选增强子序列片段，测序结果包含了完整的候选序列，与GenBank一致(图2)。对比一致是从33 bp处至1 232 bp处，长度为1 200 bp;27～32 bp处为GGTACC是KpnⅠ酶切位点，1 233～1 238 bp处为GTCGAC是SalⅠ酶切位点。

2.3 重组质粒的真核表达与功能分析

阴性对照质粒pEGFP-MU转染BEL-7402和SGC-7901细胞后荧光强度较弱;阳性对照质粒pEGFP-MUSV40e、实验载体 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8转染BEL-7402和SGC-7901细胞后荧光强度较强，其余实验载体荧光强度与阴性对照相似(图3、4)。流式细胞仪分析中以发光细胞百分比代表细胞的转染效率。质粒pEGFP-MU在BEL-7402和SGC-7901细胞中的转染效率较低，质粒pEGFPMU-SV40e、实验载体 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8转染效率较高，其余实验载体转染效率与阴性对照相似，效率较低(见表1)。

图2 第7候选片段PCR产物部分测序图Fig 2 Partial sequencing graph of of PCR product of the 7thcandidate DNA fragment

图3 各组质粒转染BEL-7402细胞荧光图Fig 3 Fluorogram of various kinds of plasmids in BEL-7402 cell

表1 各种载体在肿瘤细胞中的转染效率比较%Tab 1 Comparison of transcription efficiency of various kinds of plasmids in tumor cells %

3 讨 论

图4 各组质粒转染SGC-7901细胞荧光图Fig 4 Fluorogram of various kinds of plasmids in SGC-7901 cell

增强子是基因内的一种DNA特异序列，能够增强DNA转录活性，可与细胞核内转录因子(TF)特异结合从而极大地增强启动子活性。其结构与启动子相似，也由多个元件组成，通常为100～200 bp长度，核心组件8～12 bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在［6］。每个基因至少包含一个增强子，既可以定位于基因的两端，也可以定位在基因中间，甚至远离基因多达数千个核苷酸。但与基因编码序列不同，增强子无法仅仅根据DNA序列加以识别，必须通过实验证实。鉴定增强子的实验方法主要有DNA结构分析、序列分析和基因删除和替换等，软件预测是鉴定增强子的另一种方法，但不同的软件预测差异较大，而且结果仍需实验来验证［7］，尚难普遍应用。

本研究在前期发现SV40增强子可增强HPSE启动子表达活性［8］的基础上，参考其他文献［9-10］，选用HPSE基因启动子上、下游的部分片段作为候选序列，将其分为10段，在其上、下游引物分别添加KpnⅠ和SalⅠ酶切位点，进行PCR扩增，将其克隆插入到含有巨细胞病毒(CMV)启动子、并经改造过的真核表达载体pEGFP-MU中，构建重组载体pEGFP-MU-enhx。然后分别转染肿瘤细胞株BEL-7402、SGC-7901，通过免疫荧光观察和流式细胞仪分析方法检测增强子候选序列对CMV启动子转录活性的影响，以初步鉴定出具有增强子活性的候选序列。

为准确判断候选序列活性，本研究以未插入其他序列的质粒pEGFP-MU作为阴性对照。SV40增强子是最早发现也是迄今功能最强大的病毒增强子，其核心序列是由72 bp的碱基对重复序列构成。研究［11］表明SV40增强子修饰的人端粒酶逆转录酶启动子可以提高转录活性2～3倍，而且不影响其肿瘤特异性。我们前期研究［8］也证明，SV40增强子可以增强HPSE启动子的转录活性。本研究中我们采用PCR扩增克隆出SV40增强子序列，并引入KpnⅠ和SalⅠ酶切位点，然后将其插入到改造的质粒pEGFP-MU序列中CMV启动子上游KpnⅠ和SalⅠ酶切位点之间，构建重组质粒载体pEGFP-MU-SV40e，作为本研究阳性对照载体。电泳和测序结果表明，阳性对照质粒构建成功。

将上述3种质粒分别转染肿瘤细胞株BEL-7402、SGC-7901，通过免疫荧光观察和流式细胞仪分析方法检测各个片段对CMV启动子转录活性的影响，以初步鉴定出具有增强子活性的候选序列。

在同等条件下，将质粒pEGFP-MU、pEGFP-MUSV40e和pEGFP-MU-enhx分别转染人肿瘤细胞BEL-7402和SGC-7901。48 h后荧光显微镜下观察发现重组质粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFPMU-enh8e在人肿瘤细胞BEL-7402和SGC-7901中均表达较强的荧光，与阳性对照pEGFP-MU-SV40e相似。其余质粒比阳性对照pEGFP-MU-SV40e低，与阴性对照pEGFP-MU较接近。流式细胞仪与荧光观察结果一致。初步提示第6、7和8活性片段可以增强CMV启动子(驱动荧光蛋白表达)转录活性，且与SV40增强子相当。

肿瘤特异性启动子可驱动目的基因的靶向表达，增强子能够协同启动子显著增强治疗基因的表达水平。本研究初步筛选、鉴定了HPSE序列中具有增强子活性的3个DNA片段，为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了序列搜寻范围，并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据，具有广阔的应用前景。

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