乳兔窦房结细胞的分离及鉴定

刘如秀，刘宇，汪艳丽，彭杰，徐利亚

窦房结（sinoatrial node，SAN）是心脏传导系统中的重要组成部分，为心脏的正常起搏点，SAN病变可导致各种类型的心律失常。为了从细胞水平深入研究窦房结细胞（sinus node cell，SNC）的形态特征及电生理特性，本实验对乳兔窦房结细胞的分离、纯化、培养与鉴定方法进行了研究。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与仪器 DMEM培养基；胎牛血清（FBS）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；胶原酶Ⅱ型（Sigma公司）；5-溴脱氧尿核苷（5-BrdU，美国Sigma公司）；24小时内的新西兰乳兔，雌雄不限；动作电位的电极液。电极内液：K-Aspartate 120mmol/L、 MgCl25mmol/L、HEPES 10mmol/L、KCl 20mmol/L、Na2ATP 5mmol/L，以KOH调pH至7.2。细胞外液：NaCl 140mmol/L、KCl 5.4mmol/L、CaCl21.8mmol/L、MgCl20.5mmol/L、NaH2PO40.33mmol/L、Glucose 5.5mmol/L、HEPES 5mmol/L，以NaOH调PH至7.4。

MultiClamp膜片钳放大器（美国Axon公司）；IX51倒置显微镜（日本Olympus公司）；玻璃微电极拉制仪P-97（美国Sutter公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 乳兔窦房结细胞的分离与培养 出生24h内的新西兰乳兔5只，消毒后仰卧位固定于无菌泡沫上，剪开胸前壁，暴露心脏，在解剖显微镜下分离心包膜，于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部取2mm×2mm×2mm的组织块于DMEM中，吹打5次后置于PBS液中用眼科弯剪剪成0.3mm×0.3mm×0.3mm的小块，吸弃上清。然后加入0.08%的胰酶8ml于37℃水浴中震荡5min，吹打1min，沉淀后吸弃上清液。再次加入0.025%Ⅱ型胶原酶8ml于37℃水浴中震荡10min，沉淀后吸取上清液于50ml离心管中，离心管中加入20ml 15%FBS的DMEM培养基；再进行2次消化。用400目金属滤网，940r/min离心7min。离心后倒掉上清，加入培养液，调整细胞数为1×105/L，将单细胞悬液接种于60mm的培养皿中，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育90 min，差速贴壁以除去成纤维细胞。24h后细胞换液，此后隔天换液，每次换液均加入0.1 mmol/L 5- BrdU。在膜片钳放大器的全细胞模式下[1]，以电流钳方式记录培养窦房结细胞的动作电位。

1.2.2 细胞的形态学鉴定 倒置显微镜下观察细胞形态并以手按计数器计数细胞收缩频率，苏木精-伊红染色，置于光镜下观察。

1.2.3 培养细胞的电生理学鉴定 在膜片钳放大器的全细胞模式下，以电流钳方式记录窦房结细胞的动作电位。放大器为Axon200B, 以Pclamp软件包采集、分析数据。实验记录过程中窦房结细胞外液持续通入低流量氧。滤波频率2kHz，温度控制在（35±1）℃。

1.3 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件进行分析，所有计量资料采用（）表示。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察 差速贴壁前，接种细胞为清亮的圆形或杆状，30 min 后有细胞开始贴壁生长，大部分呈小的梭形，20h可见有细胞搏动，频率不一。2d后细胞开始出现3～4个长短不一的触角突起，5d 后细胞主要呈3 种形态：梭形、蜘蛛形与多边形。梭形细胞（图1、2）数目最多占比（61.5±6.8）%，搏动频率快，（136±12）次/min；蜘蛛形细胞胞体较大，多伸有伪足，搏动频率较梭形细胞慢（106±9）次/ min（图3）；少量多边形细胞体积较大、少伪足且无搏动，细胞平坦、胞浆清亮（图4）。

2.2 窦房结细胞的电生理特征 用电流钳技术通过全细胞记录模式检测窦房结细胞中梭形细胞的动作电位，其动作电位有舒张期自动除极化（图5）。先后记录了10个梭形细胞的动作电位，其平均最大舒张电位为（-50.9±5.3）mV，动作电位幅度为（61.9±4.8）mV。

3 讨论

准确定位乳兔窦房结的部位并取材是培养窦房结细胞的关键，直接影响着培养细胞中窦房结细胞所占的比例。本实验参考钟理等[2]的培养方法，在解剖显微镜下于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部进行取材。实验结果显示梭形细胞所占比例为60%左右，表明该取材方法较为可靠。本实验研究发现，消化酶的种类及消化时间对细胞的数量至关重要，前期研究只采用0.08%胰酶消化5min左右，发现乳兔成纤维细胞数量较少，培养的窦房结细胞更少。后对实验加以改进，采用0.08%胰酶和0.025%Ⅱ型胶原酶进行消化，发现成纤维细胞和窦房结细胞成长均佳，证明此方法培养细胞可靠。在窦房结细胞培养与纯化过程中，成纤维细胞生长速度较SNC快，影响窦房结细胞培养的纯化。但成纤维细胞贴壁速度较快，而SNC在短时间内不会贴壁或者贴壁不紧，稍加晃荡即浮起，可通过差速贴壁以纯化细胞。若在培养液中加入5-BrdU则可抑制成纤维细胞生长而对SNC无影响的目的。通过此法梭形细胞所占的比例较常规培养方法有明显的提高。通过该方法得到的SNC分散好、活性高、表面洁净，适用于膜片钳技术。

图1 窦房结细胞×20

图2 窦房结细胞×10

图3 蜘蛛形细胞

图4 多边形细胞

图5 SNC动作电位

窦房结组织学提示SNC呈梭形，浆内有少量散乱的肌微丝，无完整的肌节和明显Z线，胞核中等大小呈圆形，位于胞体中央，胞浆染色较浅，线粒体少。本研究中光镜和投射电镜观察到的梭形细胞的形态与其十分相似。膜片钳实验也发现梭形细胞动作电位的特性与分离的窦房结单细胞的特性相似，证实了本实验中的梭形细胞就是窦房结起搏细胞。通过综合应用双胰酶逐次消化结合差速贴壁及5-BrdU纯化处理进行乳兔窦房结细胞的原代培养，是可靠的培养方法，多次重复试验证明显著提高了SNC分离的数量和纯度，为SNC的研究提供了实验基础。

[1]Han X,Light PE,RilesW,et al. Identification and propertiesof an ATP-sensitive K+current in rabbit sinoatrial node pacemaker cells[J]. J Physiol,1996,490(Pt2):337-350.

[2]钟理,宋治远. 原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学研究[J]. 第三军医大学学报,2002,24(2):431-3.