不同浓度超顺磁性氧化铁纳米粒子对小鼠RAW264.7巨噬细胞的影响

韩莎莎，李俊峡

越来越多的研究表明，急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）的发生与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）斑块的稳定性密切相关，斑块脂质中心越大，纤维帽中的炎细胞（主要是巨噬细胞）越多，斑块越不稳定，越容易破裂而导致ACS的发生[1,2]。超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide，SPIO）作为一种磁共振对比剂，能被血液中的吞噬细胞特异性吞噬而标记吞噬细胞，标记后的吞噬细胞可以游走到炎症所在部位并聚集，在磁共振扫描时，造成炎症所在部位的T2弛豫时间缩短，信号减低。因此可采用SPIO增强磁共振显示AS斑块内的巨噬细胞，实现早期诊断及评估AS斑块的稳定性。随着SPIO浓度的升高，巨噬细胞的标记率提高，但是高浓度的SPIO对巨噬细胞有毒性作用。本实验通过不同浓度的SPIO标记小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过检测细胞标记率、细胞存活率、细胞增殖能力、细胞吞噬功能来评价SPIO标记RAW264.7细胞的最适浓度。

1 资料与方法

1.1 细胞与试剂 小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所；DMEM/F12培养基、胰蛋白酶/EDTA混合液为Hyclone产品；胎牛血清（FBS）为Gibcol产品；超顺磁性氧化铁（SHU555）（商品名Resovest）为德国Sehering公司产品，为荷兰鹿特丹Erasmus大学医学中心放射线科张卓立博士后提供；二甲基亚砜（DMSO）为Sigma产品；四唑盐（MTT）为Biosharp公司产品；CO2培养箱为德国Hereaus公司产品；CA950-2型超净台为上海净化仪器厂生产；倒置相差显微镜为Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基，在细胞培养箱37℃，5%CO2、饱和湿度条件下静置培养，当RAW264.7巨噬细胞生长到80%左右融合时，0.25%胰酶加EDTA混合液消化细胞，5min左右加入FBS终止消化，再加入DMEM培养基8ml左右，吹打细胞，制成细胞悬液，按1:1传代。

1.2.2 SPIO标记RAW264.7细胞 将RAW264.7细胞制成细胞悬液，以每孔2.5×105cells接种于内置盖玻片的6孔板中，加入2ml含10%FBS的DMEM培养液继续培养24h，依次向各孔中加入含有SPIO的铁浓度为14 μg/ml、28 μg/ml、56 μg/ml、84 μg/ml的含10%FBS的DMEM培养液，另设1未加SPIO的样品孔作为空白对照。37℃、5% CO2培养箱中培养24h后进行普鲁士蓝染色，光学显微镜下观察SPIO在细胞内的标记率，每个样本进行计数2个视野，每个视野至少100个细胞。再将SPIO浓度扩大10倍（即140 μg/ml、280 μg/ml、560 μg/ml、840 μg/ml）重复上述步骤。

将式(3)、(9)代入式(10)、(11)可得空间光到少模光纤耦合效率随横向偏移rb的变化曲线.由于两模光纤的模场面积较单模光纤大，且支持三个模式的模场传输，当聚焦光斑发生横向偏移时，两模光纤的LP11a模和LP11b模也会接收到信号光，少模光纤接收到的光能量要高于单模光纤，能够获得更高的耦合效率，因此少模光纤对光斑横向偏移的容忍度更高.

1.2.5 中性红吞噬实验 将RAW264.7细胞以每孔104的相同细胞密度接种于96孔培养板中，每一浓度设3个复孔，于37℃、5% CO2培养箱中培养24小时后，倒掉旧培养基，以含有SPIO的DMEM培养液与细胞共同培养24h，PBS洗涤3次，每孔加入0.7%的中性红溶液100μl，继续培养3h，弃去中性红，PBS洗涤3次，吸干，加入细胞裂解液（冰醋酸：无水乙醇=1:1）150 μl，4℃过夜，用酶标仪测定490nm处的吸光光度值。

2.2 细胞活性

鬼算盘钱通，年约四十，暗紫色长衫，外罩藏青色马褂，清瘦，一副大众面孔，那怕你和他多次见面也不会留下丝毫印象；

(4)缺乏培养新型人才的实践环境。新时期新型人才的培养更加重视理论与实践的结合，对于实践环境的要求也更高。当前，很多高校的理论课程内实验或设计在计算机机房或者实验室就可以很好地完成。但是，这些实践环境不能满足企业的要求，需要和企业进行更为紧密的合作。

1.2.3 细胞活性检测 台盼蓝试验：消化收集常规培养的未标记及含有SPIO的RAW264.7细胞悬液，并稀释至106个/ml，取9滴细胞悬液移入小试管内，加入1滴0.4%的台盼蓝，混匀，3分钟内在光镜下计数100个细胞，其中死细胞染成淡蓝色，而活细胞拒染，计数蓝染细胞数量。活细胞率=（100-蓝染细胞/100）×100%的公式计算活细胞百分率，重复测量3次。

选取2018年1—10月在我院接受治疗的60例急性单纯性阑尾炎患者作为研究对象，按照随机数字表法分为两组，每组各30例。观察组中，男17例，女13例；年龄12～79岁，平均年龄（34.86±3.92）岁；病程1～10 h，平均病程（4.06±1.33）h。对照组中，男16例，女14例；年龄19～75岁，平均年龄（35.08±3.14）岁；病程1～10 h，平均病程（4.12±1.27）h。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2 结果

2.1 普鲁士蓝染色结果 普鲁士蓝染色证实RAW264.7细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒，大部分的铁聚合物包绕在细胞核周围，而细胞核内或细胞外则未检测到（图1）。SPIO的铁浓度为84μg时，标记24小时细胞的标记率达到100%（图1b），以后随SPIO浓度的增加细胞内铁含量增加，普鲁士蓝染色的颜色越来越深（图1c～图1f），而普鲁士蓝染色的色泽是由吞噬进入细胞内铁的含量所决定的。到280μg/ml时，细胞吞噬铁含量接近饱和，以后随SPIO浓度增加，细胞内铁含量没有增加，普鲁士蓝染色未见加深。

1.2.4 细胞增殖能力检测 四唑盐（MTT）比色实验：将处于对数生长期的RAW264.7细胞以每孔103的相同细胞密度接种于96孔培养板中，每一时相每一组别设3个复孔，24h后更换培养液，以含有SPIO的DMEM培养液与细胞共同培养24h，PBS冲洗，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4h后弃去上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值（OD）。此后7天每天监测并记录细胞OD值，观察细胞对不同标记浓度的反应。

术后疼痛程度评分比较,观察组VAS评分结果(3.05±1.00)分,与对照组评分结果(5.50±1.50)分,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2.1 台盼蓝染色结果 台盼蓝排斥试验发现死细胞被染成蓝色而活细胞拒染（图2），提示SPIO浓度对细胞活性有影响，进一步行SNK多重比较检验示SPIO浓度为560μg /ml和840μg /ml的两组与其他组之间有统计学差异（P＜0.05，表1）。

2.2.2 四唑盐（MTT）比色实验结果 根据MTT比色实验所得OD值绘制细胞生长曲线（图3），当SPIO含铁浓度大于等于280μg /ml时细胞增殖受影响，与对照组及SPIO含铁浓度小于280μg/ml各组生长曲线相比差异较大，而对照组生长曲线与SPIO含铁浓度小于280μg /ml各组生长曲线相比未见明显差异。说明SPIO含铁浓度大于140μg/ml时抑制RAW264.7细胞增殖。

2.3 中性红吞噬实验结果 细胞核周围及细胞质内可见巨噬细胞吞噬的中性红颗粒（图4a），将中性红吞噬实验所得OD值绘成折线图（图4b），可见SPIO含铁浓度小于等于280μg /ml时，SPIO浓度与OD值成正比，当SPIO浓度超过280μg/ml后OD值与SPIO浓度呈反比，说明SPIO含铁浓度＞280μg/ml时，巨噬细胞的吞噬功能受到影响。

3 讨论

图1 普鲁士蓝染色结果 （SPIO的铁浓度依次为：1a：28μg /ml，1b：84μg，1c：140μg /ml，1d：280μg /ml，1e：560μg /ml，1f：840μg /ml）

表1 不同SPIO浓度下活细胞数

图2 细胞活性检测（台盼蓝染色，箭头所指处为蓝染死细胞）

图3 MTT法检测不同SPIO浓度标记RAW264.7细胞的生长曲线

全球范围内心血管疾病的发病率逐年升高，其中动脉粥样硬化及其并发症是导致死亡的主要原因。稳定性的动脉粥样硬化主要以血管腔狭窄而造成的各种缺血症状为主，而易损斑块则由于斑块破裂、血栓形成而产生如心肌梗死、脑血管梗死等急性事件。目前认为动脉粥样硬化是机体对血管内皮损伤所做出的一系列慢性炎症反应，其中巨噬细胞贯穿于动脉粥样硬化发生及发展的全过程，与斑块的稳定性密切相关[3-5]。

图4 吞噬功能检测（4a：中性红吞噬实验结果，4b：细胞吞噬实验OD值曲线）

马占龙[5]等的研究证实动脉粥样硬化斑块中，巨噬细胞吞噬SPIO使大量纳米铁颗粒在斑块局部聚集，进而引起了MRI信号的改变，从而可实现粥样斑块活体检测。Raynal等[6]实验表明，SPIO可通过巨噬细胞的“清道夫”受体（scavenger recep tors SR2A）被吞噬，而很少被内皮细胞和平滑肌细胞摄取[7-9]。这些研究提示通过巨噬细胞吞噬SPIO在磁共振下显影可实现在体无创检测及监测富含巨噬细胞的易损斑块的病变发展，指导临床治疗及预防工作。但需要寻找合适的SPIO浓度，SPIO浓度过高会对细胞产生毒性作用影响细胞功能及活性，SPIO过低则不能清晰显影粥样硬化斑块。本实验主要通过不同浓度SPIO体外标记RAW264.7小鼠巨噬细胞对巨噬细胞活性和标记率的影响评估了体外标记巨噬细胞的最适浓度。发现SPIO含铁浓度84μg/ml即可达到巨噬细胞100%标记，140μg/ml以下不影响细胞增殖，280μg/ml以下不影响细胞吞噬功能。对日后进一步体内及体外研究SPIO对巨噬细胞结构及功能的影响奠定了基础。

但是，本研究仅从细胞活性和吞噬能力两方面评价了不同浓度SPIO对RAW264.7细胞的影响，没有对标记的细胞进行磁共振显影，无法比较不同浓度SPIO标记的RAW264.7细胞在磁共振下显影的效果，也没有通过电子显微镜观察对细胞超微结构的影响，仍需后续进一步研究。

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