MicroRNA-29 a对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

2013-08-22 12:08张凤香李晨光孙大鹏罗俊生
中国老年学杂志 2013年5期
关键词:反义平滑肌空白对照

张凤香 关 宁 李晨光 孙大鹏 罗俊生

(辽宁医学院附属第一医院心外科,辽宁 锦州 121001)

血管平滑肌细胞(VSMC)位于血管中膜,是血管中层惟一的细胞成分,VSMC既可以调节血管张力,又可以维持血管功能。研究表明VSMC的增殖、迁移是高血压、动脉粥样硬化血管重塑等内膜增厚性疾病的重要病理生理因素。microRNA和一般的RNA一样都是由基因编码的。microRNAs的基因广泛存在于各个染色体中,这些microRNAs虽然只占人类基因总数的2%,却调控着人类30%以上的基因表达。研究发现多个MicroRNA在血管平滑肌细胞中特异表达,并可以对血管平滑肌细胞的增殖和迁移进行调节,从而影响动脉粥样硬化斑块的形成。MicroRNA-29 a不但参与肿瘤形成、免疫炎症反应、细胞因子分泌、葡萄糖代谢等过程,还可以在VSMC大量表达。因此,本实验就MicroRNA-29a对VSMCs增殖和迁移的影响进行研究,以探讨其治疗心脑血管性疾病的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠,100~180 g(武汉大学实验中心);DMEM、胎牛血清(Hyclone公司);胰蛋白酶、CCK8试剂盒(GIBCO公司);MicroRNA-29 a反义寡核苷酸(上海生工);兔抗鼠PCNA抗体、兔抗鼠 MMP-9、MMP-2抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体、PCR试剂盒、HRP标记山羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥公司)。

1.2 细胞培养及转染 选取100~180 g雄性 SD大鼠,取胸腹主动脉血管中膜,用贴块法分离、培养 VSMC。细胞在含10%FBS的DMEM中生长至汇合后,0.25%胰蛋白酶消化传代,取3~6代细胞进行实验。MicroRNA-29 a反义寡核苷酸转染按照lipofectamine2000说明书操作,将VSMC分为3组:空白对照组(加入同等量的lipofectamine2000);MicroRNA-29 a反义寡核苷酸(50 nmol/L)组:MicroRNA-29a错义链(50 nmol/L)组,5 h后换完全培养基,显微镜下观察转染效率。

1.3 MTT法检测VSMCs活力 将处于对数生长期的 VSMC接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,贴壁后转染,分别于转染后24 h、48 h、72 h用MTT法检测细胞增殖状态。每组每孔取200μl加入96孔板板中,每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT液,37℃5%CO2继续培养4 h,去上清,每孔加入100μl DMSO充分溶解。用酶标仪测定各孔吸光度值,波长570 nm。

1.4 划痕法检测VSMCs迁移 取对数生长期VSMCs接种于培养皿,调整细胞浓度以致第2天覆盖达到约90%,按上述分组进行转染。在培养皿底部做一直线标记,用无菌枪头在无菌条件下沿标记线作划痕,PBS液漂洗后加入含1%FBS的DMEM,孵育12 h后重新加入含10%FBS的 DMEM,37℃、5%CO2培养。分别在0、24、48、72 h于各组镜下随机选取10个视野进行拍摄,测量两边细胞迁移边缘之间的距离即划痕宽度,然后取均值。

1.5 Western印迹检测MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白的表达转染48 h后常规提取总蛋白,每孔加入20μl蛋白溶液,电泳分离后转膜,体积分数5%牛奶封闭2 h,加入一抗,4℃孵育过夜。TBST清洗后,加入二抗孵育1 h,TBST清洗。加入ECL发光液100μl,在ImageQuant RT ECL冷 CCD成像系统进行显影,用Imagequant TL软件进行半定量分析。

1.6 RT-PCR检测相关mRNA的表达 转染48 h后收集并计数各组细胞,用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,经紫外分光光度计检测RNA浓度,参照反转录试剂盒说明书进行发转录反应。反转录PCR法检测;PCNA:正义链5'-ACCACCATCACCACCATCATC-3',反 义 链'-TGGAAGAGTTGGAGCACAGG-3';MMP-9:正义链 5'-GAACATCATCCCTGCCTCCAC-3',反义链'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3';MMP-2:正 义 链 5'-GUAAUCGAGAGGCUGAGUA-3',反 义 链 5'-UACUCAGCCUCUCGAUUAC-3';MicR-29a:正义链5'-GGAGAGGAACTGGACTGGCTC-3',反义链'-CCAGCCAAGGTTGAGGTTGCA-3';β-actin:正义链5'-GTCGAGACACGATGGTGAAGGT-3',反义链5'-TTCTCAGCCACCGTGCCG-3'。扩增条件:第一步:95℃ ×30 s;第二步:95℃ ×5 s,60℃ ×10 s,72℃ ×15 s,循环35 次。

1.7 统计学分析 采用SPSS13.0 for windows统计软件进行处理。数据以x±s表示,各组数据进行正态性和方差齐性检验,两样本的均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 MicroRNA-29 a对VSMCs活力的影响 结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比较,MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组VSMCs体外增殖能力明显被抑制 (P<0.05),而阴性对照组与空白对照组之间比较无显著差异 (P>0.05),说明抑制MicroRNA-29 a的表达可以抑制 VSMCs的增殖(见表1)。

表1 MicroRNA-29 a对VSMCs体外增殖的影响(x ± s,n=6)

2.2 MicroRNA-29 a对VSMCs迁移能力的影响 结果显示,在0 h时划痕宽度均为(380.71±9.12)μm。随着时间的延长,与阴性对照组和空白对照组比较,MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组VSMCs迁移能力明显被抑制(P<0.05),而空白对照组与阴性对照组相比无明显差异(P>0.05),说明抑制MicroRNA-29 a的表达能显著抑制VSMCs的迁移(见表2)。

2.3 MicroRNA-29 a对MMP-9、MMP-2和PCNA mRNA表达的影响 转染48 h后,与阴性对照组和空白对照组比较,MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组MMP-9、MMP-2和PCNA mRNA表达明显被抑制(P<0.05),而空白对照组与阴性对照组相比无明显差异(P>0.05)(见图1)。

2.4 MicroRNA-29 a对MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表达的的影响 作用48 h,Western印迹检测结果发现,与阴性对照组和空白对照组比较,MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组 MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表达均明显被抑制,而空白对照组与阴性对照组相比无明显差异(见图2)。

表2 MicroRNA-29 a对VSMCs迁移能力的影响(μm,x ± s,n=6)

图2 Western印迹检测microRNA-29a对VSMC中MMP-9、MMP-2和PCNA表达的影响

3 讨论

目前已经发现多个miRNA在VSMC中特异表达,并能调节VSMC的增殖和迁移,从而影响高血压和动脉粥样硬化斑块的形成过程。研究发现MicroRNA145是正常血管壁和血管平滑肌细胞中最多表达的MicroRNA,并能抑制血管新生内膜的生长〔1〕。Elia等〔2〕发现 Microrna145 和 Microrna143 对血管平滑肌的表型及分化有调节作用。Liu等〔3〕发现低表达的MicroRNA221和MicroRNA222基因能抑制血管平滑肌细胞的增殖。MicroRNA-29 a是一个遗传上高度保守的miRNA,在体内几乎所有的细胞内表达。已经证实MicroRNA-29 a参与肿瘤形成、免疫炎症反应、细胞因子分泌、葡萄糖代谢等过程。在心血管系统中MicroRNA-29 a不但与心脏纤维化相关,还与动脉粥样硬化的形成有关〔4〕,但MicroRNA-29 a是否参与VSMC的增殖和迁移尚不见报道。本研究说明MicroRNA-29 a可以影响VSMC的增殖和迁移。PCNA是一种分子量为36 kD的核蛋白,在VSMC的增殖中起重要作用,当VSMC发生增殖时,PCNA的表达量明显升高〔5〕。本文表明MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组PCNA的表达也被明显抑制。基质金属蛋白酶(MMPs)通过降解ECM,导致血管中层VSMC迁移至内膜,这与AS斑块形成病理过程密切相关〔6〕。本研究结果表明,MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组能更有效地抑制MMP-2和MMP-9的表达。

1 ChengY,Liu X,Yang J.MicroRNA-145,a novel smooth muscle cell phenotypic-marker and modulator,controls vascular neointimal lesion formation〔J〕.Circ Res,2009;105(2);158-66.

2 Elia L,Quintavalle M,Zhang J,et al.The knockout of miR-143 and miR-145 alters smooth muscle cell maintenance and vascular homeostasis in mice:correlates with human disease〔J〕.Cell Death Differ,2009;16(12):1590-8.

3 Liu X,Cheng Y,Zhang S,et al.A necessary role of miR-221 and miR-222 in vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia〔J〕.Circ Res,2011;104(4):476-87.

4 van RE,Sutherland LB,Thatcher JE,et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2008;105:13027-32.

5 Li GH,Chen YF,Stacey SK,et al.Estrogen attenuates integrin-3-dependent adventitial fibroblast migration after inhibition of osteopontin production in vascular smooth muscle cell〔J〕.Circulation,2000;101:2949-55.

6 Johnson JL.Matrix metalloproteinases:influence on smooth muscle cells and atherosclerotic plaque stability〔J〕.Expert Rev Cardiovasc Ther,2007;5(2):265-82.

猜你喜欢
反义平滑肌空白对照
小麦不同肥力下经济效益试验研究
外源性透明质酸对人牙周膜细胞增殖及成牙骨质、成纤维分化的影响
认识反义词
反义疑问句小练
例析阴性对照与阳性对照在高中生物实验教学中的应用
原发性肾上腺平滑肌肉瘤1例
喉血管平滑肌瘤一例
这山望着那山高
镜像治疗截肢后幻肢痛的随机对照试验
原发性腹膜后平滑肌肉瘤的CT和MRI诊断