虎金丸对肝纤维化大鼠Nrf2/Bach1蛋白表达的影响

符 崖 黄兆胜 熊天琴 李红侠 赵玉民 廖嘉仪

广州中医药大学，广东广州 510006

在肝纤维化的发生发展中，氧化应激起着重要作用，机体氧化/抗氧化的失衡，是肝脏炎症及肝纤维化的发展重要因素之一。核因子相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）、转录因子 Bach1（BTB and CNChomology1）在机体氧化/抗氧化失衡的调节中起着重要的作用，Nrf2通过调节肝脏抗氧化酶基因的表达增加肝脏抵抗氧化应激的能力；Bach1为Nrf2的阻遏剂，和Nrf2竞争ARE下调抗氧化酶基因的表达[1-4]。

虎金丸由虎杖、郁金、田七、灵芝、泽泻、山楂6味组成，具有活血化瘀、益气行滞的功效。临床上用于治疗肝纤维化有较好的疗效[5]。研究表明虎金丸能保护CCl4所致大鼠肝细胞急性损伤，具有确切的抗肝纤维化作用[6]。本研究采用CCl4诱导的大鼠肝纤维化，观察虎金丸对肝纤维化大鼠Nrf2/Bach1蛋白表达的影响，初步探讨虎金丸调整机体氧化应激抗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠，SPF级，体重150～180g，购自广州中医药大学实验动物中心，生产许可证号SCXK（粤）2008-0020。

1.2 药物及试剂

虎金丸供试液系按处方比例各药材加水煎煮2次，过滤，浓缩为含生药1g/mL，临用时稀释备用；阳性对照药水飞蓟素（陕西森弗高科实业有限公司）；四氯化碳（广州光华化学厂有限公司，批号20110930）；MDA、SOD、GSHPx检测试剂盒（南京建成生物研究所）；兔抗Nrf2多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，规格1mg/mL），兔抗Bach1多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，规格37μg/150μL）。Elevision plus免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）；Masson三色染色液（广州威佳科技有限公司，批号20110315）；苏木素和伊红（Sigma进口分装，批号 20110211）。

1.3 仪器

7080型日立全自动生化分析仪器株式会社日立高新技术）；UV-754紫外可见分光光度计（上海科学精密仪器有限公司）；TG-16-WS台式高速离心机（长沙湘仪离心机器有限公司）；体重计，大连星海电子衡器有限公司；MIAS图像分析系统（广州中医药大学一附院病理室）；MSHOT数码成像系统（广州市明美光电技术有限公司）。

1.4 造模及给药方法

雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、水飞蓟素组、虎金丸组，每组10只。模型组和给药组皮下注射40% CCl4花生油溶液（将CCl4与花生油以4∶6配成40%油剂），首次0.5mL/100g，随后0.3mL/100g，隔天1次，持续6周。正常组皮下注射等体积的花生油，时间与模型组相同。造模结束后，给药组灌胃相应药物，每日1次，共4周。模型组、正常组灌胃等体积的蒸馏水。为了防止肝脏自然修复对实验结果的影响，除正常对照组外，各用药组开始给药后仍同时每周注射40% CCl4油剂0.3mL/100g体质量1次[7]。

1.5 采集标本

末次给药前禁食不禁水12h，末次给药后1h，用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采集血液，将血液室温静置2h后，2500r/min，离心20min，取上清，-80℃保存备用。采集血液后将动物处死取肝脏标本，置于冰0.9%氯化钠溶液中充分洗涤后，称重，取肝右叶标本1cm×1cm×0.5cm，用10%（v/v）的中性甲醛固定，制备石蜡切片。取肝左叶用生理盐水制成10%的肝匀浆。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 肝脏组织病理学观察 肝组织病理学检查采用胶原纤维染色（Masson法），在光镜下观察大鼠肝组织肝纤维化程度并拍照。MIAS医学图像分析管理系统分析并自动计算胶原纤维面密度。

1.6.2 分光光度法检测 检测肝组织匀浆中SOD、GSH-Px含量

1.6.3 免疫组化法检测肝组织匀浆Nrf2、Bach1的蛋白量的差异 肝组织标本经10%甲醛液固定，石蜡包埋，4μm连续切片贴于经APES处理的载玻片。免疫组化按Elevision plus试剂盒要求操作。PBS代替一抗作为阴性对照。用MSHOT数码成像系统采集图像，MIAS医学图像分析管理系统分析并自动计算平均光密度。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 Masson染色胶原纤维观察

正常组肝组织形态结构正常，除肝中央静脉周和肝血窦周见少量的网状纤维，无明显胶原纤维增生。模型组肝组织结构被破坏，肝索排列紊乱，局部的网状纤维融合形成胶原纤维条索，使肝小叶中央区和汇管区的纤维间隔相互连接，改建肝小叶结构和血液循环形成了假小叶。肝组织损伤减轻，肝索排列整齐，胶原纤维增生显著减少。

在Masson染色中，纤维蛋白呈黄绿色，运用MIAS医学图像分析管理系统分析胶原纤维的面密度，根据面密度值判断大鼠纤维化的程度。与正常组比较，模型组的面密度显著增大（P＜0.01），面密度值为（0.206±0.059）。与模型组比较，水飞蓟素与虎金丸均能显著减低纤维蛋白的含量（P＜0.01），且虎金丸的作用更显著。见表1。

表1 Masson染色胶原纤维面密度结果比较（± s）

表1 Masson染色胶原纤维面密度结果比较（± s）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 n 面密度正常组 8 0.014±0.008模型组 8 0.206±0.059▲▲水飞蓟素组 8 0.100±0.035**虎金丸组 8 0.079±0.037**

图1 大鼠肝组织Masson染色胶原纤维观察（100倍）

2.2 大鼠肝组织匀浆中GSH-Px与SOD含量的变化

与正常组相比，模型组的抗氧化酶GSH-Px与SOD含量均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，两药物组均使GSH-Px与SOD含量显著升高（P＜0.01），表明药物的使用增强了机能的抗氧化酶含量，达到了保护肝脏的作用。见表2。

表2 大鼠肝组织匀浆中SOD、GSH-Px的含量比较（± s）

表2 大鼠肝组织匀浆中SOD、GSH-Px的含量比较（± s）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

水飞蓟素组 10 256.291±58.119** 552.267±25.055**虎金丸组 10 254.718±7.854** 528.869±66.003**

2.3 大鼠肝组织匀浆Nrf2、Bach1蛋白的改变

与正常组比较，模型组肝细胞浆中的Nrf2蛋白显著升高（P＜0.01），Bach1蛋白显著降低（P＜0.01）。见图2：A1、A2、B1、B2。与模型组比较，虎金丸、水飞蓟素组肝细胞胞浆中的Nrf2蛋白显著降低，Bach1蛋白显著增高（P＜0.01）。见图2：C1、C2、D1、D2。两组之间的蛋白水平差异小。见表3。

3 讨论

肝纤维化是各种肝损伤的共同的终末阶段。正常的肝纤维结缔组织的生成与分解保持动态平衡，当肝组织受到不同损伤时（如药物性、酒精性损伤），肝纤维组织弥漫增生大于分解，导致肝纤维化[8]。研究表明，虎金丸对诱导的大鼠肝纤维化有较好治疗作用，能够保护肝细胞，抑制胶原纤维增生，其机理与抗脂质过氧化有关[9]。现代药理研究表明，虎杖鞣质具有较好的抗脂质过氧化的作用[10]，郁金主要有效成分姜黄素通过清除自由基、抑制脂质过氧化反应发挥其抗氧化活性[11]，田七中的三七总皂苷抑制脂质过氧化反应[12]，灵芝的主要活性成分灵芝多糖、泽泻总提物、山楂提取物均具有抗氧化作用[13-15]。

表3 大鼠肝组织细胞浆Nrf2、Bach1蛋白的平均光密度值比较（± s）

表3 大鼠肝组织细胞浆Nrf2、Bach1蛋白的平均光密度值比较（± s）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 n Nrf2-A Bach1-A正常组 8 0.171±0.024 0.190±0.011模型组 8 0.248±0.015▲▲ 0.149±0.010▲▲水飞蓟素组 8 0.194±0.021** 0.204±0.021**虎金丸组 8 0.198±0.024** 0.201±0.006**

图2 大鼠肝组织细胞浆Nrf2、Bach1蛋白的表达（200倍）

CCl4是最经典和广泛应用的肝毒性物质，一般认为CCl4在肝细胞内经微粒体酶活化生成自由基，启动脂质过氧化，造成肝损伤与纤维化[16]。从Masson染色结果来看，模型大鼠肝脏组织出现结构破坏、肝索紊乱、胶原纤维增生与假小叶等肝纤维化现象，而虎金丸能改善肝纤维化，降低胶原纤维面密度。

机体受到氧化应激损伤后，细胞浆中Bach1核移位进入细胞核内和Nrf2竞争ARE，Nrf2出核降解，细胞浆中Nrf2水平增加，抗氧化酶的表达水平下降。抗氧化处理时，细胞浆中Nrf2进入细胞核，与抗氧化反应元件（ARE）结合，上调抗氧化酶的表达，Bach1的核移出，细胞浆中Bach1水平增加[17-18]。实验表明，模型组肝细胞组织匀浆中的Nrf2表达显著高于正常组，Bach1则显著低于正常组，SOD、GSH-Px等抗氧化酶的表达的水平与活性低于正常组，提示在氧化应激过程中Nrf2核移出，机体抗氧化酶水平降低。在药物组中，抗氧化药物的使用使机体的氧化/抗氧化失衡得到了调节，肝细胞组织匀浆中Nrf2水平回落，细胞浆中Bach1水平提高，SOD、GSH-Px等抗氧化酶的表达的水平与活性也得到了提高。这说明虎金丸可调控Nrf2/Bach1蛋白在肝细胞组织匀浆中的表达，通过核因子水平的变化调整SOD、GSHPx等抗氧化酶的含量与活性，从而达到调整氧化应激抗肝纤维化的作用。

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