猪TREM-1基因的克隆与启动子分析

李 辉，应诗家，施振旦

(江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014)

髓样细胞触发受体1(Triggering receptor expressed on myeloid cells 1，TREM-1)是2000年发现的一种新型免疫球蛋白超家族成员，分子量约为30000，主要分布在外周血中性粒细胞、单核细胞亚群等天然免疫反应的效应细胞和肺泡吞噬细胞等细胞表面［1］。研究表明，TREM-1受体在炎症反应中起着重要作用［2-3］，适度表达有助于加速机体对病原体的清除，过度表达则使TREM-1与其下游细胞因子形成正反馈自分泌调节回路，促使炎症反应增强放大，导致过度的炎症反应［4-7］，最终引起机体细胞损伤和多脏器功能衰竭，严重时将危及动物的生命。因此TREM-1被认为是整个炎症反应中的关键触发节点［8］。而通过降低TREM-1基因的表达或阻断其信号传导通路，可有效改变炎症发生的规律，抑制炎症过度反应的发生，提高被感染动物的生存率［9-10］。

TREM-1基因自发现后，多集中于人和小鼠炎症相关领域的研究上，在家畜上的研究较少，目前只在牛［11］、水牛［12］和猪［13］上有报道。对于猪的TREM-1基因，GenBank仅收录了3条 mRNA(CDS)序列(登录号分别为:AY382477、AY382476和NM213756)，而没有包含启动子在内的全基因序列的资料。重要信息的缺乏，造成人们对其结构(例如:外显子和内含子的数目、长度以及启动子序列的长度、重要顺式作用元件的数量和碱基构成等)了解较少，也因此阻碍了对该基因的进一步研究。基于上述问题，本试验拟利用Genome walking技术克隆猪TREM-1基因包括启动子在内的全部DNA序列，并对该基因的结构和启动子序列进行详细生物信息学分析，旨在为猪TREM-1基因功能的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及材料

DNA genome walking kit、LA-Taq高保真DNA聚合酶、pMD18-T克隆载体购自大连TaKaRa公司，DH5α感受态细胞购自南京鼎国生物技术有限公司，DNA凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，猪基因组DNA由本实验室冻存。试验所用引物由Invitrogen公司合成，其他均为常规试剂。

1.2 方法

1.2.1 猪TREM-1基因全序列的Genome walking PCR 根据GenBank收录的猪TREM-1基因mRNA序列(登录号:NM213756)，在3'端下游设计3条特异性引物，分别命名为SP1、SP2和SP3。根据DNA genome walking kit中所提供的随机引物(AP)，以猪基因组DNA为模板，依次用引物SP1、SP2和SP3，按照试剂盒说明书推荐的反应程序进行3次交错式热不对称PCR反应(特异性引物的设计原则及详细的PCR操作过程按DNA genome walking kit说明书进行)。最后将3次PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳分析。如果Genome walking PCR成功，以SP3为引物的PCR会有特异扩增产物。电泳检测时，所对应的泳道在紫外灯下可观察到特异条带。将特异条带切胶纯化回收后接入pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送生物公司进行测序，然后对获得的DNA序列进行比对分析。确定序列正确后，以测序获得的DNA序列为模板，在其5'端上游重新设计3条特异性引物，进行下一轮的热不对称PCR反应，向未知序列区延伸，操作过程同上。直至最终获得猪TREM-1基因及其启动子的全序列。

1.2.2 猪TREM-1基因的拼接比对及启动子区序列的分析所获得的全部DNA序列测序正确后，利用DNAStar、Bioedit7.0等软件进行拼接。拼接后的DNA序列与GenBank收录的登录号为NM213756的序列利用Aligen(bl2seq)进行双序列比对分析，获得外显子和内含子的数量、界限和长度。利用在线启动子分析软件Alibaba2.1(www.gene-regulation.com/pub/programs/html#alibaba2.1)，对获得的猪TREM-1基因启动子区序列进行预测，分析启动子内调控其转录的重要顺式作用元件的位置、数量及碱基构成。

2 结果

2.1 猪TREM-1基因序列的拼接和比对

经过多轮热不对称PCR反应，回收特异性条带并测序后，将所得DNA序列拼接，获得了包括启动子序列在内的猪TREM-1基因共32414 bp。将拼接序列与GenBank中收录的mRNA序列(NM213756)进行Aligen比对分析。结果发现，其启动子区长度为10863 bp(1～10863)，结构基因长度为 21551 bp(10864～32314)，转录起始位点为第10864碱基。并且发现该基因由4个外显子和3个内含子组成。其中第一外显子长度为108 bp(10864～10971)，主要为编码信号肽的序列，翻译起始密码子(ATG)位于第10923碱基处。第一内含子长度为12550 bp(10972～23521)，第二外显子长度为357 bp(23522～23878)，第二内含子长度为1347 bp(23879～25125)，第三外显子长度为204 bp(25126～25330)，第三内含子长度为 6713 bp(25331～32043)，第四外显子长度为 371 bp(32044～32414)。终止密码子和PloyA加尾信号序列分别位于第32044碱基和第32394碱基处。目前已将克隆所得的全基因序列提交至GenBank，分配的登录号为KC688694。

2.2 猪TREM-1基因启动子序列分析

通过在线启动子分析软件Alibaba2.1分析发现，在猪TREM-1基因启动子序列中，与转录相关的重要顺式作用元件大部分分布于转录起始位点上游5000 bp的范围内。该区域中含有典型的TATA框(TATATATT)，位于转录起始位点上游-681 bp处。同时发现多个与维持启动子基本转录活性相关的顺式作用元件，如Sp-1(7个)、C/EBP(4个)以及NF-1(4个)等。而且上述各元件均坐落于邻近TATA框的区域，位置的邻近可能更方便转录复合物的组装和转录的启动。另外还发现应答LPS刺激和调控TREM-1基因表达的转录因子结合位点，例如:NF-κB(5个)、Ap-1(4个)以及PU-1(1个)等因子。3种转录因子结合位点集中于转录起始位点上游 -1600～-4500 bp的区域。

3 讨论

本研究首次克隆并注释了猪TREM-1基因的全基因组序列，对该基因的结构有了较深入的了解。并对启动子区的重要转录因子结合位点进行了预测分析。在启动子序列中找到了与调控TREM-1基因表达相关的NF-κB、Ap-1和PU-1等转录因子结合位点。在TREM-1基因表达中，NF-κB是其中最重要的转录因子，LPS与胞外受体结合后，经过一系列反应，最终引起抑制状态的IκB的磷酸化，磷酸化后成为具有活性的NF-κB，并转移至细胞核中，与TREM-1基因启动子序列中的结合位点结合，促进 TREM-1基因的表达［14-17］。目前在小鼠TREM-1基因启动子的研究中发现3个NF-κB结合位点。受到LPS刺激时，最末端的结合位点在提高TREM-1基因表达的过程中起主要作用［18］。同时还发现在LPS刺激时，AP-1可与c-cos/c-jun协同作用共同促进TREM-1的表达［18］，而PU-1则在负调控TREM-1基因表达方面有着不可替代的作用［19-21］。受到LPS刺激后，NF-κB和AP-1会迅速结合到TREM-1基因启动子上，并启动表达。但是PU-1的结合较慢(约15 min后才开始结合)［20］。在本研究中，虽然已通过分析获得了重要转录因子的结合位点，但仍须进一步验证。

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