OM-APS复方及其组分对新城疫疫苗免疫效果的影响

邢玉娟， 陈玉库， 胡元亮， 王德云， 陈 茜， 郭振环， 王君敏， 赵晓娜

(1.江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏 泰州 225300;2.南京农业大学中兽医学研究室，江苏 南京 210095)

研究证明，中药作为一种免疫增强剂，具有来源广泛、效果显著、无毒副作用等优势，不仅能克服油乳类、铝胶类化学佐剂副作用大、局部刺激重、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊病［1-2］，而且能显著增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌［3-4］。

在以前的研究中，笔者首先通过体外试验筛选出氧化苦参碱(OM)、黄芪多糖(APS)等具有显著抑制新城疫病毒(NDV)增殖作用的中药成分，然后比较了中药成分复方体外抗NDV感染的效果，结果表明中药成分复方无论是高浓度，还是中、低浓度都能显著抑制NDV感染鸡胚成纤维细胞(CEF)［5］。通过临床试验比较了中药成分复方对雏鸡人工感染新城疫的疗效，结果表明，在攻毒前、与攻毒同时和攻毒后给药，中药成分复方均能显著降低受试鸡的死亡率，提高血清NDV抗体效价，减轻死亡鸡的器官出血［6］。

本试验在测定了OM、APS、甘草酸(GA)、桅子苷(GP)等4种中药成分体外对鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响，筛选出具有较好增强免疫效果的OM和APS基础上，拟使用OM和APS的中药成分复方OM-APS(OAP)及其组分药配合新城疫疫苗免疫，测定雏鸡免疫后外周血T淋巴细胞增殖、血清抗体效价和细胞因子的变化，旨在阐明中药成分复方免疫增强的作用机理，为研制中药成分免疫增强剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物准备

根据以前的试验结果［5-6］，分别用双蒸水将OM、APS 和 OM-APS(OAP)稀释成 4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml，分别代表高、中、低 3 种浓度，常规消毒后备用。

1.2 疫苗和病毒

新城疫Ⅳ系(Newcastle Disease virusⅣ strain，NDV-Ⅳ)疫苗，中牧股份南京药械厂生产，批号753-3。新城疫检测抗原，由南京农业大学动物医学院中兽医研究室提供。

1.3 主要试剂

RPMI1640培养液，Gibco公司产品，按说明书用三蒸水配制后过滤除菌，分装，4℃保存，临用前加入犊牛血清达5%和青霉素、链霉素各100 IU/ml;植物血凝素(PHA)，上海伊华科技有限公司产品，用 RPMI1640培养液配制成 0.1 mg/ml，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后－20℃保存;四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液，Amresco公司产品，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，使终浓度为5 mg/ml，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃冰箱避光保存;淋巴细胞分离液，上海恒信化学试剂有限公司产品;淋巴细胞裂解液，二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，苏州正兴化工研究院产品。

1.4 试验动物

1日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡700羽，购自南京汤泉农垦种鸡场。试验期间采用笼养，全价饲料，自由采食和饮水，1～14日龄采用红外灯保温，全日制光照。

1.5 试验设计

雏鸡饲养至14日龄去除病弱鸡，选取660羽［平均体重95 g，平均母源抗体效价(2.4±0.5)lg2］，随机均分为11组。第1～9组为OAP高剂量组(OAPH)、OAP中剂量组(OAPM)、OAP低剂量组(OAPL)、OM高剂量组(OMH)、OM中剂量组(OMM)、OM 低剂量组(OML)、APS高剂量组(APSH)、APS中剂量组(APSM)和 APS低剂量组(APSL)，第10组为疫苗对照组，第11组为空白对照组。除空白对照组外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、点眼免疫，每羽1份。28日龄二免。在首次免疫的同时，3个中药复方组分别口服高、中、低剂量的OAP、OM和APS，免疫对照组和空白对照组口服等量生理盐水，每天1次，连续3 d。在首次免疫同时，分别于14、21、28、35、42 日龄采血，抗凝血 MTT 法测定外周血淋巴细胞增殖，非抗凝血血清用β-微量法测定HI抗体效价。于14、28、42日龄，采血分离血清，用ELISA方法检测IL-2和IFN-γ的含量。

1.6 淋巴细胞增殖测定方法

采用MTT法［3-4］测定淋巴细胞增殖情况。将抗凝血样(每羽2 ml)用Hank’s液稀释1倍，小心加在淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min离心20 min，吸取中间云雾状白细胞层，用无血清RPMI1640营养液洗2遍，每分钟1 500 r/min离心15 min。台盼蓝染色，细胞计数，活细胞大于90%后，用RPMI1640营养液调整细胞浓度为1 ml 2.5×106个，加入到96孔细胞培养板(德国Nunclon公司生产)中，每孔80 μl，再加20 μl PHA，每个样品重复 4 孔，然后置于39.5℃、5%CO2条件下(CO2培养箱，美国 Revco 公司产品)培养44 h，每孔加入 MTT溶液20 μl，继续培养4 h后，每孔加裂解液100 μl，将细胞板置于微量振荡器(75-2A型，上海医用分析仪器厂生产)上振荡5 min使沉淀完全溶解，在酶联免疫仪(DG-3022型，中国华东电子管厂生产)上检测570 nm处的吸光值(A570)作为T淋巴细胞增殖的指标。

1.7 抗体效价测定方法

在96孔微量血凝板上，从左到右每孔各加50 μl PBS液，再向每排的第1孔加入50 μl待检血清，依次向后倍比稀释直至第12孔，然后向每孔加入50 μl 4个单位的抗原，在微量振荡器上振荡混匀后置于温箱中感作20 min。取出向每孔加入50 μl鸡红细胞悬液，同时设阳性血清、阴性血清及空白对照孔。振荡混匀后置于37℃温箱中感作30 min，待对照孔红细胞已经沉淀时观察结果［7］。

1.8 IL-2 和 IFN-γ 的测定

分离血清后按照试剂盒说明书测定IL-2和IFN-γ的含量。

1.9 数据处理

数据采用平均数±标准差表示，用SPSS软件12.0统计分析，比较各组间的差异性。

2 结果

2.1 淋巴细胞增殖的变化

从表1可以看出，免疫组各时间点A570值均显著高于空白对照组(P＜0.05)。OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在雏鸡各日龄段，OAPL和APSL在 21、28、35 和 42 日龄，OML在 21、28 和 42日龄的A570值显著高于免疫对照组;OAPH在雏鸡各日龄段，A570值均显著高于 OMH和 APSH(P＜0.05);OAPM在28日龄 A570值高于 APSM，但差异不显著，其余日龄段 A570值均显著高于 OMM和APSM(P ＜0.05);复方组(OAPH、OAPM、OAPL)和OMH、APSH在21日龄A570值达到高峰，其余各单味药对照组在28日龄达到高峰。

表1 淋巴细胞的增殖Table 1 Proliferations of T lymphocytes

2.2 抗体效价的变化

从表2可以看出，所有处理抗体效价均显著高于空白对照组(P＜0.05);OAPH、OAPM在雏鸡14日龄，OMH、OMM在 21 日龄，OAPH、OAPM、OAPL、OMM和 APSM在 28 日龄，OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在 35 日龄，OAPH、OAPM、APSM在 42 日龄抗体效价显著高于免疫对照组;OAPH的抗体效价在各时间点均显著高于OMH和APSH(P＜0.05);OAPM抗体效价在21、28、35、42 日龄显著高于OMM，21、28和35日龄显著高于APSM(P＜0.05);OAPL抗体效价在28日龄显著高于OML(P＜0.05)。

表2 血清抗体效价的变化(lg2)Table 2 Changes of the serum antibody titers(lg2)

2.3 血清中IL-2水平的变化

从表3可以看出，所有免疫组血清IL-2浓度均显著高于空白对照组(P＜0.05);OAPH、OAPM、OAPL、OMH、OMM、APSH、APSM在各日龄段、OML在42日龄、APSL在14和42日龄血清IL-2浓度均显著高于免疫对照组(P＜0.05);OAPH在各日龄段血清IL-2浓度均显著高于OMH和APSH，OAPM在各日龄段血清IL-2浓度均显著高于OMM和APSM，OAPL在28、42日龄血清 IL-2浓度显著高于 OML和 APSL(P＜0.05)。APSL和空白对照组血清中IL-2浓度在14日龄达到高峰，然后下降，其余各组均在28日龄达到峰值。

表3 血清中IL-2浓度的变化Table 3 Changes of IL-2 concentrations in serum

2.4 血清中IFN-γ 水平的变化

从表4可以看出，口服中药的9个处理在雏鸡各日龄段血清IFN-γ浓度均显著高于空白对照组(P＜0.05);OAPH、OAPM在雏鸡各日龄段血清IFN-γ浓度均显著高于免疫对照组(P＜0.05)。APSH、APSM在28和42日龄，OAPL在42日龄，OMM在42日龄血清IFN-γ浓度均显著高于免疫对照组(P＜0.05)。OAPH在雏鸡各日龄段血清IFN-γ浓度均显著高于OMH和APSH，OAPM在28、42日龄血清IFN-γ浓度显著高于 OMM和 APSM(P＜0.05)。OAPL、OMH、OMM、OML、APSL和免疫对照组血清中 IFN-γ浓度在14日龄达到高峰，然后下降，其余各组均在28日龄达到峰值。

表4 血清中IFN-γ浓度的变化Table 4 Changes of IFN-γ concentrations in serum

3 讨论

3.1 中药成分复方及其组分药对细胞免疫和体液免疫的影响

淋巴细胞增殖是反映机体细胞免疫水平的一个重要指标［7］。细胞免疫可以通过致敏淋巴细胞与相应抗原作用而发挥抗病原体感染、抗肿瘤、帮助B淋巴细胞产生抗体等作用。唐雪明和孔祥峰等也通过体内外试验证实黄芪多糖及其复方具有提高鸡淋巴细胞增殖的作用，并且具有一定的剂量效应［8-9］。本试验结果表明，与免疫对照组比较，OAP、OM、APS均具有增强淋巴细胞增殖的作用，高剂量的效果优于低剂量。

血清抗体效价反映机体体液免疫状态，体液免疫是机体抗御感染的主要因素之一，通过抗原-抗体结合反应而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多种作用［10］。王德云等亦研究报道黄芪多糖及其复方等具有提高机体特异性抗体的效果，高剂量促进抗体生成的作用强于低剂量［7］。本试验结果表明，与免疫对照组比较，OAP、OM、APS均具有提高新城疫特异性抗体的作用，增强机体体液免疫的效果，且高剂量效果优于低剂量。

3.2 中药成分复方及其组分药对细胞因子分泌的影响

细胞因子是一类主要由免疫细胞产生的极微量的具有广谱生物学活性的小分子肽，是免疫系统重要调节因子，病原感染或疫苗接种产生的细胞因子决定免疫反应的类型和程度。IL-2是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，可以辅助CTL细胞表达杀伤功能，IFN-γ是由T淋巴细胞不同的亚群分泌的免疫调节因子，具有广泛抗病毒、抗肿瘤和双向免疫调节作用，同时对不同免疫细胞间相互作用和发挥免疫功能具有重要的介导作用［11］。

本试验结果表明，OAP、OM、APS均具有促进细胞因子分泌，提高血清中IL-2和IFN-γ浓度的作用。并且在选用的剂量中，高剂量和中剂量组在雏鸡多个日龄段提高血清中2种细胞因子浓度的作用强于低剂量。马霞、王德云、陈玉库等也通过试验证明，黄芪多糖、氧化苦参碱和黄酮等中药成分及其复方体内外均具有促进IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子分泌，攻毒保护试验也表明细胞因子高剂量用药组保护率也相应高于低剂量用药组［12-14］。

3.3 复方增强免疫作用与单味组分药的比较

本试验结果表明，OAP是由OM和APS组成的复方，在促进淋巴细胞增殖、提高特异性抗体生成、增加细胞因子分泌等增强免疫作用方面，同等剂量复方多优于单味组分药，表明两种组分药有协同作用。王德云等研究当归多糖、黄芪多糖及其复方等对培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖、抗体生成、细胞因子分泌的影响，也得到相似结果［7，13］。范云鹏等研究中药成分黄酮及其复方增强免疫作用时，也发现复方的作用效果优于单味成分［15］。研究只报道了中药或中药成分复方的生物活性高于其单味药的现象，这可能与中兽医的配伍理论有关，具体机制仍需进一步研究。

综合以上结果，OAP增强雏鸡对新城疫疫苗的免疫效果最好，可作为新型免疫增强剂的候选药方。鉴于中、高剂量的效果多差异不显著，推荐临床使用OAP中剂量配合疫苗使用。

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