复合益生菌对高热环境中仔猪生长性能、肠道菌群和热休克蛋白表达的影响

蒋加进， 甘 芳， 胡志华， 陈兴祥， 刘永杰， 黄克和

(1.金陵科技学院动物科学与技术学院，江苏 南京 210038;2.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

随着养猪业集约化程度的不断提高和全球逐渐变暖，高热是影响猪只生长和健康的主要因素。中国夏季的时间普遍较长，江苏省地处中国东部，长江、淮河下游，由于受温带向亚热带的过渡性气候影响，加之近年来全球气候变暖形势日益严重，一般年份都会出现20～30 d的高温天气，梅雨期短的年份高温日数可超过40 d［1］，猪只每年都要经受长期的急性或慢性热应激，这严重制约了猪生产的效率，给养猪业带来巨大损失。近年来，许多研究者报道了高温热应激对猪采食量、免疫功能和血液中激素水平的影响［2-3］，但对于热应激的机理尚未完全阐明，防控也未能取得很好的效果。因此，寻找各种抗热应激的方法和在日粮中添加某些营养素成为目前养猪业研究的重点之一。

益生菌(Probiotic)起源于希腊文字，又名促生素、生菌剂、原生菌、微生态制剂、活菌制剂等，联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)将其定义为“当摄入一定量时能对宿主的健康有作用的活的微生物”［4］，主要包括乳酸菌类、双歧杆菌类、芽孢杆菌类、光合细菌类和酵母类等。研究表明，益生菌能通过竞争性排斥病原、增强肠道屏障功能来防止肠道感染，维持肠道菌群平衡，提高免疫力，控制血清胆固醇，抗肿瘤等［5-7］。此外，益生菌能产生多种维生素，还能产生短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等，对机体的生长发育起着重要作用。近来有报道，益生菌具有缓解家禽热应激的能力［8］，但应用益生菌尤其是应用复合益生菌对猪热应激的影响鲜有报道。

热休克蛋白(Hsps)属于应激蛋白家族，可出现于所有物种［9-11］。根据其分子量大小，可分为小Hsps、Hsp60、Hsp70和 Hsp90。热应激和其他应激(如运输、重金属离子应激)，可迅速诱导合成Hsp，保护细胞和机体免受应激损伤［12］。近来有研究报道，热应激可增强鸡Hsp70的表达［13］，益生菌(嗜酸乳杆菌)可降低热应激细胞中热休克蛋白的表达［14］。但益生菌对高热环境中猪Hsp mRNA水平的影响未见报道。

本试验通过在饲料中添加不同剂量的复合益生菌，研究其对高热环境中仔猪生长性能、肠道菌群和Hsp mRNA表达的影响，为研制猪热应激饲料添加剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 复合益生菌制剂

试验用复合益生菌制剂由南京农业大学动物医学院营养代谢病研究室研制，1 ml含活菌数≥109个。复合益生菌主要成分为嗜酸乳杆菌和酵母菌等。

1.2 动物分组

选择体重相近的45头同批次35日龄三元杂交(杜×长×大)仔猪，随机分成3组，每组3个重复，每重复5头。

1.3 试验饲粮配方及试验处理

试验基础饲粮采用常规玉米豆粕型日粮，配方为:玉米 620.0 g/kg、豆粕 280.0 g/kg、乳清 50.0 g/kg、赖氨酸10.0 g/kg、甲硫氨酸 3.8 g/kg、色氨酸2.9 g/kg、苏氨酸 8.4 g/kg、盐 4.0 g/kg、磷酸氢钙6.4 g/kg、碳酸钙4.0 g/kg、预混料10.0 g/kg。其中1 kg预混料含维生素A 2 200 IU、维生素D 200 IU、维生素E 30 mg、维生素B14.4 mg、维生素B24 mg、维生素 B64 mg、维生素 B1215 μg、烟酸 22 mg、泛酸9 mg、生物素0.10 mg、叶酸0.35 mg以及微量元素Cu(CuSO4·5H2O)18 mg、Mn(MnSO4·H2O)55 mg、Fe(FeSO4·7H2O)80 mg、Zn(ZnSO4·7H2O)80 mg、I(KI)0.14 mg。在基础饲粮中分别添加1%复合益生菌(试验1组)、3%复合益生菌(试验2组)饲喂仔猪，对照组饲喂基础日粮。

1.4 饲养管理与样品制备

猪的饲养试验于2012年夏天在江苏苏北某猪场进行。水泥料槽，乳头式饮水器，每天喂料3次，自由采食和饮水，圈舍窗户全部打开，自然通风，每天记录猪舍温度，猪舍气温变动范围为26～40℃。按猪场常规管理程序给试验猪免疫和驱虫。预试7 d，进入正试期后，各组分喂相应日粮42 d。分别在35日龄(正式试验之前)和77日龄(试验结束)前腔静脉采血，每头猪各10 ml，EDTA抗凝。

1.5 生长性能的测定

试验前和试验结束时仔猪各称体重1次，记录体重和耗料量，计算各组的平均日增重、平均日采食量和料重比(耗料/增重)。

1.6 腹泻率的测定

试验开始后，每日观察仔猪排粪情况，记录腹泻猪只数和持续时间，最后以每窝仔猪发生腹泻的头日数除以总的饲养头日数计算出腹泻率。

1.7 肠道菌群的测定

在35日龄及77日龄采取健康仔猪新鲜粪样测定大肠杆菌和乳酸杆菌数量。大肠杆菌用麦康凯培养基，乳酸杆菌用乳酸杆菌培养基，在37℃恒温箱中培养。粪样的采集、稀释、培养和计数等参照文献［15］方法进行，培养基制备参照文献［16］方法进行。

1.8 Hsp70和Hsp27 mRNA水平测定

根据已发表的2个热休克蛋白基因和1个内参基因序列，用Primer primer(PREMIER Biosoft International，USA)设计引物，引物参数见表1。总RNA的提取采用Trizol试剂盒(TaKaRa，China)按照说明书操作进行，采用 DNA-free kit试剂盒(TaKaRa，China)清除DNA污染，最后通过1.5% 琼脂糖凝胶电泳和蛋白核酸测定仪检测所提取的RNA质量。Real-time PCR反应体系与PCR扩增条件参照TaKaRa公司 PrimeScript RT-PCR Kit试剂盒说明书。Real-time PCR扩增在7300 Real-time PCR System［美国应用生物系统公司(ABI)生产］上进行。所得试验数据均以β-Actin为内参基因，按△△Ct法进行比较分析，结果用2－△△Ct表示。

表1 荧光定量PCR的引物Table 1 Primers for fluorescent quantitative PCR

1.9 数据处理

采用SPSS统计软件17.0对数据进行方差分析，试验结果用平均数±标准差表示，并用LSD法检验分析各组间均数差异的显著性。

2 结果

2.1 复合益生菌对高热环境下仔猪生长性能和腹泻率的影响

试验期间仔猪平均日增重、平均日采食量和料重比的测定结果见表2。与对照组相比，添加1%、3%复合益生菌试验组平均日增重分别提高了3.49%、10.48%(P＜0.05)，料重比分别下降了3.46%、8.84%(P＜0.05)，腹泻率分别下降了29.84%(P＜0.05)、51.29%(P＜0.05)。说明，日粮中添加复合益生菌制剂对高热环境中断奶仔猪的生长有良好的促进作用，可显著降低腹泻率。

表2 复合益生菌在高热环境下对仔猪生长性能与腹泻率的影响Table 2 Effect of multi-probiotics on the growth performance and diarrhea incidence of piglets under hyperthermic conditions

2.2 复合益生菌对高热环境下仔猪肠道菌群水平的影响

各组35日龄和77日龄试验猪肠道大肠杆菌和乳酸杆菌数结果见表3。饲喂饲料42 d后，1%和3%复合益生菌组77日龄猪粪便中的大肠杆菌数均显著低于对照组(P＜0.05);而乳酸杆菌数均显著高于对照组(P＜0.05)。

2.3 复合益生菌对高热环境下仔猪 Hsp70和Hsp27 mRNA水平的影响

饲喂复合益生菌后仔猪血液中热休克蛋白基因Hsp70和Hsp27 mRNA水平的变化见图1、图2。日粮中未添加复合益生菌前，各组血液中Hsp70和Hsp27 mRNA水平差异不显著，说明正式试验前各组基本处于同等水平。饲喂添加复合益生菌的饲料42 d后，3%复合益生菌组血液中热休克蛋白基因Hsp70和Hsp27 mRNA水平显著低于对照组(P＜0.05)，而1%复合益生菌组血液 Hsp70和 Hsp27 mRNA水平与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。

图1 饲喂不同日粮后仔猪血液中Hsp70 mRNA水平的比较Fig.1 The levels of Hsp70 mRNA in the blood of piglets fed on different diets

图2 饲喂不同日粮后仔猪血液中Hsp27 mRNA水平的比较Fig.2 The levels of Hsp27 mRNA in the blood of piglets fed on different diets

3 讨论

3.1 复合益生菌对高热环境下仔猪生长性能的影响

已有研究表明，在高温环境下，猪的采食量和日增重降低，说明高温会降低猪的采食量和日增重。据报道，硒和维生素E可清除热应激猪体内的自由基，提高猪对高温的耐受力［17］，也有报道称益生菌能缓解家禽的热应激［18］。本试验结果表明饲料中添加3%复合益生菌对缓解断奶仔猪的热应激效果较好，能有效改善断奶仔猪的生长性能，促进采食，提高日增重和饲料利用率，显著降低腹泻率。

3.2 复合益生菌对高热环境下仔猪肠道菌群的影响

动物消化道内存在着种类繁多的微生物，与自身的营养、生长、免疫抵抗病原菌入侵和消除某些化合物的毒性等都有密切关系［19］。肠道内乳酸杆菌等有益菌的存在，可以分解碳水化合物，产生多种有机酸，它们的增殖不但能提高机体的消化机能，促进营养物质的吸收，而且能竞争性地抑制某些入侵的病原菌或抑制肠道内的有害菌的增殖，对畜禽的健康有益。本试验使用的复合益生菌能显著降低大肠杆菌等条件致病菌的数量，显著增加乳酸杆菌等有益菌的数量，有助于恢复和保持正常胃肠道功能，增加胃肠蠕动，促进消化吸收，提高仔猪增重和降低料耗。

3.3 复合益生菌对高热环境下仔猪Hsp mRNA水平的影响

热应激蛋白(Heat stress response protein)是指机体受到应激原的刺激后产生的一组高度保守的蛋白质，对维持细胞生存和内环境的稳定起重要作用，可以被高温及各种使机体应激的因素如射线、重金属离子、细菌或病毒感染以及中毒、缺氧所诱导［20］。HSP70是此类蛋白中最保守、最重要的一种［21］。HSP70在应激状态下可在细胞内迅速合成并转移到细胞核内、核仁等区域，促进变性、损伤蛋白质的恢复或清除，维持细胞的自身稳定，可以提高机体的应激耐受能力而起到保护机体的作用。本研究结果表明，与对照组相比，饲料中添加3%复合益生菌可显著降低高热环境下断奶仔猪血液中热休克蛋白基因Hsp70和Hsp27 mRNA水平，表明在高热条件下，复合益生菌有可能是通过调节Hsp70和Hsp27 mRNA的水平来缓解仔猪热应激的。因此，复合益生菌在夏天自然高热应激条件下可作为一种潜在的仔猪抗热应激添加剂。

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