硫氧还蛋白还原酶与循环系统疾病

袁 媛（综述），谷 翔（审校）

（九江学院附属医院心内科，江西 九江 332000）

硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TrxR）是一种包含黄素腺嘌呤二核苷酸 （flavin adenine dinucleotide，FAD）结构域的二聚体硒蛋白，是唯一能够催化形成还原型硫氧还蛋白的硒酶。由于其广泛的底物特异性，能参与到各种氧化还原、炎症、细胞凋亡等生理过程中。由TrxR、硫氧还蛋白（Trx）和还原型辅酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）组成了硫氧还蛋白系统。硫氧还蛋白系统是细胞内最重要的抗氧化系统之一，同时具有修复蛋白质活性、清除氧自由基和促进肿瘤生长等作用。TrxR广泛分布于原核细胞和各类生物体细胞中，主要有3种同工酶，分别为TrxR1、TrxR2和 TrxR3。 有研究［1］证实，TrxR 在肿瘤、寄生虫、感染性疾病、免疫缺陷性疾病、类风湿性关节炎及循环系统等疾病中发挥重要作用。循环系统疾病是威胁人类健康的主要疾病，它与炎症反应和氧化应激有着密切的联系。本文就TrxR的结构、功能及其与循环系统疾病相关的基础研究进展进行如下综述。

1 TrxR

自1977年Holmgren等［2］在牛的组织中分离纯化出来TrxR后，人们相继在大肠杆菌等原核生物、昆虫、植物、酵母菌和哺乳动物中发现了 TrxR［3－4］。1996 年，Tamura 等［5－6］从人类肺腺癌细胞和 T 细胞中纯化得到的TrxR，同时发现它是含硒的蛋白质，哺乳动物的TrxR能够催化多种反应，大大高于低级生物中TrxR的生物活性。因此对于哺乳动物的TrxR研究较为透彻。

1.1 TrxR的分类

TrxR根据其在机体的分子质量，可分为大分子TrxR和小分子TrxR两大类。大分子TrxR主要分布在哺乳动物中，其分子质量为55～65 ku。小分子TrxR主要分布在原核生物、植物、酵母和某些原生动物中，其分子质量为35 ku。

目前TrxR的研究主要集中在哺乳动物中。有研究［7-8］发现，哺乳动物中TrxR主要有3种同工酶，根据其分布区域的不同，分为TrxR1、TrxR2和TrxR3。TrxR1主要分布在组织细胞浆中，也是目前研究和了解最多的一种同工酶；TrxR2主要分布在线粒体中；TrxR3主要分布在睾丸组织中，因其额外的N-末端单侧的谷氧还蛋白区域，能催化还原态谷胱甘肽，故被称为硫氧还蛋白和谷胱甘肽还原酶（thioredoxin and glutathione reductase，TGR）。

1.2 TrxR的结构

目前研究［9］发现，所有哺乳动物的TrxR结构中都包含硒半脱氨酸（Sec）。在TrxR结构中，硒半脱氨酸位于C-末端，以-Gly-Cys-sec-Gly-序列存在于各种TrxR同功酶中。硒半脱氨酸由密码子UGA翻译，容易与硫氧还蛋白和其他蛋白形成氧化还原反应，是TrxR产生生物活性的重要结构。TrxR2其N-末端有一碱性残基，由33个氨基酸组成，与TrxR1有84%的序列相似度。Rigobello等［10］在大鼠肝脏中、Watabe 等［11］在牛的肾上腺皮质中均提纯出TrxR2，因此推测，TrxR在肝脏和心脏的功能形成上起着重要作用。TrxR2在细胞中以ATP的形式产生大量的能量，同时参与了细胞的凋亡。Nalvarte等［12］研究表明，TrxR2过量表达的HEK-293细胞比对照细胞有更强的抵抗线粒体复合物Ⅲ诱导的毒性作用。TrxR3的N-末端富含精氨酸，形成α-螺旋；另有一含硫的谷胱甘肽区域，能催化谷胱甘肽和硫氧还蛋白保持其还原态。因TrxR3主要存在于睾丸中，故其与男性生育能力有一定的关系。

1.3 TrxR的生物学活性

1.3.1 调节氧化还原反应

TrxR是一类含有硒半脱氨酸的氧化还原酶，以二聚体的形式存在，其中含有一个二硫键和一个FAD。它能催化Trx上的-s2还原成（-SH）2，即维持Trx的还原型。哺乳动物中的TrxR较低等生物具有更广泛的底物特异性，除了能直接还原Trx外，也能还原其他非二硫化合物，如维生素C、亚硒酸盐、脂质氢过氧化物酶、VK3、氧化型谷胱甘肽等。TrxR的广泛特异性可能与C-末端的硒半脱氨酸氧化还原活性位点有关。TrxR必须通过还原型辅酶Ⅱ（NADPH）提供电子来还原 5，5’=硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB），因此根据此反应中NADPH的减少量可作为检测TrxR活性的方法。Trx在TrxR的催化下，从氧化型转变为还原型。还原型的Trx（Trx-（SH）2）能够还原许多失活蛋白质的二硫键，从而恢复失活蛋白质的生物活性。通过TrxR的作用，Trx在氧化型和还原型2种状态中转化，构成了机体内氧化还原反应的良性循环［13］。

1.3.2 调节细胞增殖

还原型Trx可刺激肝细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞等多种细胞增殖。Trx能启动转录因子与DNA结合，过量表达Trx可促进核因子NF-κB的反式激活。TrxR的活性直接决定还原型Trx在机体中的含量，因此TrxR在细胞增殖中有着重要作用。细胞增殖关键步骤的核酸代谢，TrxR作为核糖核苷酸还原酶转运体，从NADPH处接受电子，将核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸，从而形成DNA。有研究者为了验证TrxR的细胞增殖作用，将野生型和半胱氨酸突变型的TrxR基因进行比较，发现突变型的TrxR因缺乏硒半脱氨酸残基，有效地抑制了TrxR还原氧化态的Trx；同时突变型的TrxR基因表达的细胞增殖速度明显较野生型降低［14］。Wipf等［15］研究证实，螺环酮缩醇衍生物作为TrxR抑制剂，在乳腺癌患者中使用，检测出乳腺癌细胞中TrxR表达下降，同时乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7生长呈明显抑制状态。在体外培养细胞宫颈癌Hela、肝癌Bel-7402、鼻咽癌KB及胃癌BGC-823中，加入TrxR抑制剂——新型有机硒化合物1,2-［二（1,2-苯并异硒唑-3（2H）-酮）］乙烷（BBSKE），结果发现各组细胞生长抑制率明显高于对照组，且TrxR活性下降率与细胞生长抑制率呈正相关。

1.3.3 抗氧化应激

氧化物和抗氧化物在细胞内的平衡对于细胞的功能、调节和适应各种生长条件是极为重要的。活性氧（reaetiveoxygenspeeies，ROS）是机体有氧代谢的一个有毒产物，过量产生可能会导致氧胁迫，使细胞发生不可修复的损伤，最终导致细胞凋亡。线粒体是生理和病理状态下活性氧的的主要来源，而TrxR2主要分布在线粒体中。有研究［16］证实，缺乏TrxR2的的大鼠由于增加的氧化应激而在胚胎期死亡，部分能够存活的小鼠也表现出线粒体功能低下，对诱导的氧化应激损伤较正常组更为敏感。Kabuyama等［17］研究发现，类风湿性关节炎患者滑膜细胞中ROS含量增加，提示滑膜细胞通过氧化应激程度升高，同时滑膜细胞中TrxR1蛋白水平上调，滑膜细胞通过TrxR1蛋白水平的上调，抑制了其凋亡，抵抗氧化应激对细胞的损伤。4-羟壬烯醛（4-HNE）能通过提高TrxR活力和mRNA水平，诱导适应性反应和加强PC12细胞的耐受力，保护细胞防御氧化应激。

1.3.4 调节细胞凋亡

TrxR活力被抑制能迅速诱导细胞死亡，TcrxR的活力依赖于硒半脱氨酸的活性位点。TrxR中的硒半脱氨酸残基具有很高的亲和性，能够与亲电子化合物结合形成硒半脱氨酸修饰的TrxR衍生凋亡蛋白（selenium compromised thioredoxin reductasedercived apoptotic proteins，secTRAPs），从而能有效和直接地诱导细胞死亡，这种细胞死亡具有凋亡和坏死2个特征。Lindner等［18］分离出与RA-IFN诱导细胞死亡相关的基因GRIM，结果显示:GRIM-12编码了TrxR，反之抑制了TrxR，细胞死亡效应也明显减弱。Trx的还原活性在TNF/ASKI诱导的非JNK依赖的凋亡通路中起到决定作用。TrxR被抑制后，细胞将通过恢复还原型的Trx及其他抗氧化酶的活力 （包括TrxR），和以坏死或凋亡表现的细胞死亡来响应。在乳腺癌细胞中分离出野生型和突变型，并植入无胸腺的大鼠中，对大鼠进行干扰素-β（IFN-β）和全反式维甲酸（ATRA）联合治疗。结果发现，野生型TrxR的肿瘤被联合作用所抑制消退，相反，突变型TrxR的肿瘤不消退，同时在消退的肿瘤中标记到凋亡信号。也有研究［19］将TrxR进行突变分析，即去除C-末端的结构域，结果激活了TrxR依赖的死亡效应，并促进了p53依赖的基因表达。

1.3.5 调节其他生理过程

抗坏血酸是血浆和细胞膜内重要的抗氧化剂。它能还原a-生育酚，过氧化物和活性氧，能预防动脉粥样硬化斑块的形成。抗坏血酸自由基的再循环需TrxR来完成。长期给予大鼠低硒饮食，可发现肝细胞中抗坏血酸盐、谷胱甘肽过氧化酶和TrxR水平降低。Curbo等［20］发现，由脂多糖和Hela细胞诱导的单核细胞能够将IL-4的二硫键还原为巯基。同时加入不同浓度的TrxR阻滞剂金诺芬，结果显示:高浓度组的金诺芬二硫键数目明显高于低浓度组和对照组，说明TrxR能够还原IL-4，阻断其信号传导通路。

2 TrxR与循环系统疾病

2.1 冠状动脉粥样硬化性心脏病

有研究［21］表明，氧化应激和炎症在冠心病的发生发展过程中起到重要作用。炎性条件下生成的活性氧不仅能导致血管细胞凋亡及血管张力丧失，而且能诱导多种趋化因子（如MCP-1）和血管黏附分子（如VCAM-1和ICAM-1）的表达，进而加重炎症反应的进程。其中动脉粥样硬化的危险因素包括高同型半胱氨酸血症（HCY）、高血糖、高血脂等。为了解Trx、TrxR和同型半胱氨酸与冠心病的联系，Wu等［22］收集了150例冠心病患者并使用他汀类药物和122例无冠心病的正常人。结果发现，相比正常组，冠心病组显著增加了TrxR的活性和HCY水平。根据HCY再进一步分组，Trx活性在HCY＜15组中明显降低，与HCY水平呈负相关，但是与TrxR活性无明显相关。血糖、血脂均不能显著影响Trx和TrxR活性。从而得出结论，在冠心病患者中，高HCY水平能导致Trx活性的降低，并与冠心病的程度和严重性紧密相关。Trx在多种心血管病变的组织中均有较高的表达。用原位杂交和免疫组化的方法发现人动脉粥样硬化斑块（特别是内皮和巨噬细胞）中Trx的mRNA和蛋白水平均有显著增高。除了Trx，人的冠状动脉粥样硬化组织标本中存在高表达的谷氧还蛋白（Grx）。此外，球囊损伤所致大鼠动脉新生内膜中也存在着高表达的Trx［23］。这些发现均提示动脉粥样硬化及血管新生内膜增生受到氧化还原状态的调节，而Trx和Grx这2个二硫键还原酶在此过程中可能发挥着重要的作用。

2.2 高血压病

高血压病的发生、发展与ROS的过度生成造成氧化应激和（或）机体内抗氧化能力降低密切相关。循环系统ROS的来源主要有氧化酶、解耦联的内皮型一氧化氮合酶。特别是NADPH氧化酶被视为高血压病理过程中ROS的主要来源。机体抗氧化系统能力的降低直接导致高血压患者的氧化应激损伤。清除ROS，从而维持细胞的还原状态和抑制心室重构至关重要。多数高血压患者存在着抗氧化酶活性下降和含量降低的情况，如超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，SOD），谷胱甘肽氧化酶和过氧化氢酶等。ROS水平的升高导致氧化应激水平增加会诱导血压的升高，而高血压又会进一步促进ROS的生成增加和组织氧化损伤。最近的研究［24］表明，血管紧张素Ⅱ （angiotensinⅡ，AngⅡ）可激活NADPH氧化酶，导致线粒体的功能障碍，促使线粒体产生过剩的 ROS，如过氧化物（O2-）、H2O2和过氧亚硝基。ROS通过减少NO生物利用度和活化凋亡信号使内皮功能产生障碍，从而促进高血压病的发生。在心脏TrxR不仅作为主要的抗氧化物，而且能与许多重要的信号分子和转录因子相互作用，从而调节各种细胞的功能。而TrxR2主要存在于线粒体中，在AngⅡ诱导的高血压及心肌肥大等方面起着重要作用。Matsushima等［25］研究证实，高表达的TrxR2大鼠在心肌损伤后能够有较好的预后。同时，也有研究［26］证实，利用高表达TrxR2的转基因大鼠，证实在AngⅡ诱导的高血压中,TrxR2表达上调，且NADPH氧化酶表达和线粒体源性ROS产量减少，从而保留了NO的生物利用度，维持内皮细胞功能。有研究显示，心脏中的内源性TrxR基因沉默后会增加氧化应激和心肌肥厚的概率［27］，急性抑制TrxR会消除预处理治疗所诱导的心肌保护效应。

2.3 心肌炎

心肌炎的发生发展与ROS密切相关，ROS清除剂能明显改善心肌炎的症状。低硒可以降低许多脏器TrxR的活性。长期低硒喂养，大鼠肝、肾等组织中的TrxR活性明显下降，而脑、脾、前列腺中TrxR活性无明显改变，说明肝、肾TrxR活性对硒营养敏感，而脑、脾、前列腺等组织敏感性较差。滕宗艳等［28］采用低硒饲料喂养大鼠14周，大鼠心肌中TrxR活性降低到对照组的63.18%，说明心肌TrxR活性对硒营养较敏感。进一步应用Western blot杂交检测心肌中TrxR的蛋白表达水平后发现，低硒组蛋白水平较对照降低，提示长期低硒心肌TrxR活性降低是由于酶特异活性降低和蛋白合成减少所致，推测可能是硒元素以SeCys形式插入减少引起的。心肌中TrxR活性降低，导致酶的还原功能减弱，使心肌抗氧化能力降低，易受损伤。因此，低硒心肌损伤的发生与TrxR功能障碍有关。一些药物可能通过上调硫氧还蛋白的表达以实现其细胞保护作用。替莫普利是一种血管紧张素转化酶抑制剂，用它处理大鼠能增加心肌中Trx的表达。替莫普利能减轻大鼠自身免疫性心肌炎的损伤程度，很可能与Trx的抗氧化功能有关［29］。

3 小结

综上所述，TrxR在维持循环系统的生理功能和保护机体细胞免受各种病理情况下的氧化损伤中起着重要的作用。深入研究TrxR在循环系统疾病发生过程中的机制以及在信号传导过程中的作用尤为关键，这对更好地利用TrxR预防和治疗循环系统疾病具有重要指导意义。

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