Ⅱ型胶原纤维α1基因（COL2A1）在视网膜脱离中的作用的研究进展

陈王浩 陈浩宇

视网膜脱离（Retinal detachment,RD）是一种严重的致盲性疾病，是指视网膜神经上皮与色素上皮分离。根据其病理机制的不同可分为孔源性视网膜脱离、牵拉性视网膜脱离和渗出性视网膜脱离三种类型，但视网膜脱离的分子遗传学机制目前尚不太清楚。近20年来，绝大多数与视网膜脱离相关的分子遗传学研究成果均来自针对伴有视网膜脱离的综合征的研究。其中Ⅱ型胶原纤维α1 基因（COL2A1）与视网膜脱离的关系是当前研究的热点。

1 COL2A1基因及其编码产物

1.1 COL2A1基因：COL2A1全称为Ⅱ型胶原纤维α 1，位于12 号染色体的长臂12 q 13.11 上，共包含31538 个碱基对，包括54 个外显子。COL2A1编码Ⅱ型胶原蛋白前肽，这些Ⅱ型胶原蛋白前肽从细胞内分泌到细胞外基质中，最终组装成“纤维”状的成熟的Ⅱ型胶原蛋白。

1.2 Ⅱ型胶原蛋白：Ⅱ型胶原蛋白是一种同源三聚体结构，由三个折叠成棒状三股螺旋α多肽链组成。Ⅱ型胶原蛋白分布在人类的软骨、眼的玻璃体，以及钙结合蛋白的细胞外间隙及细胞外基质中；其在软骨组织中最常见，而在玻璃体视网膜组织中仅有少量分布。

1.3 Ⅱ型胶原蛋白的结构特点及其分泌过程[1]

1.3.1 Ⅱ型胶原蛋白的结构特点：胶原的基本定义包含2个要素：（1）包括多个以Gly-X-Y模式重复排列的氨基酸序列（Gly代表甘氨酸，X通常代表脯氨酸，Y通常代表4-羟脯氨酸）；（2）这些重复排列的Gly-X-Y氨基酸序列必须要拥有3 条链形成3 股螺旋结构的潜在能力。COL2A1基因第1-5 外显子编码Ⅱ型前胶原蛋白的N端,第6-48 外显子编码三螺旋结构的核心区,第49-52 外显子编码C端。这3 条多肽链折叠成一个杆状的3 股螺旋分子。构成胶原分子3 股螺旋结构的每条链以左手螺旋的方式延长，每圈包括3 个氨基酸。每条链都叫做α链。甘氨酸是最小的氨基酸，而这些氨基酸序列以Gly-X-Y的方式排列，这样甘氨酸就可以处于有利位置，使3 条α链连接在一起。这个特点对维持大分子结构的稳定性非常重要。

1.3.2 Ⅱ型胶原蛋白的生物合成过程：Ⅱ型胶原蛋白的生物信息从COL2A1基因转录到mRNA上，mRNA被转运到细胞质的粗面内质网，在粗面内质网mRNA进行翻译；肽链的起始和延长从mRNA的羧基末端到氨基末端进行（即从C端到N端）；在肽链延长的过程中，“Y”位置的4-羟脯氨酸被羟化酶转变为5-羟脯氨酸。只有形成螺旋结构的肽链才能被羟化修饰，这样留下了大概200～300 个氨基酸残基未被羟化修饰，3 股链的每条链的羟基末端前肽与自身相折叠，并通过链间二硫键固定。各条链之间通过羟基末端前肽和链间的二硫键连接起来。一旦3 条链通过羟基末端连接起来，3 聚体就开始向氨基末端（N'端）增值延长。3 聚体组装完成后，通过高尔基体被分泌到细胞外间隙。在细胞外间隙中，3 聚体去掉N端和C段延长物，成为成熟的Ⅱ型胶原蛋白，并再次经过组装成为纤维状。COL2A1发生突变时可导致Ⅱ型胶原蛋白结构变性或分泌异常，最终导致相关疾病的发生。

2 COL2A1基因突变合并视网膜脱离的相关疾病

Ⅱ型胶原蛋白广泛分布在人类的软骨、眼的玻璃体中，COL2A1基因突变多引起全身系统性疾病，部分疾病合并视网膜脱离。目前已发现的COL2A1基因突变可引起的疾病有：软骨成长不全、Stickler综合征、Kniest脊柱骨骺发育不良综合征、轻度软骨发育不良的骨关节炎、先天性脊椎骨骺发育不良、Strudwick类型先天性脊椎骨骺发育不良、spondyloperipheral 发育不良、platyspondylic lethal skeletal dysplasia、原始股骨头坏死、家族遗传性孔源性视网膜脱离、Ccruch发育不良跖骨类型。其中4种疾病出现视网膜脱离的临床表现：Stickler综合征、Kniest 脊柱骨骺发育不良综合征、家族遗传性孔源性视网膜脱离、马歇尔综合征（Marshall 综合征）。

2.1 Stickler综合征：也称作关节眼病（arthro-ophthalmopathy），是一种常染色体遗传性结缔组织疾病，是由编码不同胶原蛋白的基因突变引起的。临床表现以眼、耳、关节、骨骼系统的病变为特点，包括高度和进展性近视伴有玻璃体液化和视网膜脱离，进展性的神经性听力下降，腭裂，下颌骨发育不全以及骨关节疾病。该病具有高度的临床异质性，可分为5 种亚型，分别由COL2A1、COL11A1、COL11A2、COL9A1、COL9A2五个基因突变所引起。其中1 型Stickler综合征，临床表现以眼部病变为主要特征，全身症状较轻微。其余四种类型均伴有不同程度的全身其他系统的症状。

Stickler于1965年首次报道大多数Stickler综合征患者携有COL2A1基因突变[2]。该研究显示COL2A1基因突变可以导致眼部、颅面部、听力系统、骨关节系统临床症状。但Stickler没有发现究竟是哪些突变会导致眼部疾病。Ahmada于1991年发现了一个位于COL2A1上的基因突变，该突变仅针对眼部组织（全部6 名家系成员都有视网膜脱离，而全身症状相对轻微甚至于无）[3]。可以认为该突变是第一个被发现的可导致视网膜脱离的基因突变。该突变位于基因序列al-732 位点，为单个碱基突变（胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，C→T）,使氨基酸密码子由CGA转化为TGA。TGA是一个终止密码子，导致基因转录和翻译的过程提前终止，所生产的多肽链被缩短。而这种变短的多肽链是无法参与Ⅱ型胶原纤维的合成的。显然，这种位于COL2A1基因上的沉默突变可以导致Ⅱ型胶原蛋白的生成量减少。

2.2 Kniest发育障碍：Kniest发育障碍是一种常染色体遗传疾病，主要临床表现为：侏儒症，联合腭裂、听力缺陷、近视、视网膜脱离等症状。该病的遗传学研究报道较少，被研究的家系也较少。目前该疾病的遗传学研究表明，编码Ⅱ型胶原蛋白的COL2A1基因突变是其致病原因[4-6]。这3 篇报道均提示COL2A1基因的杂合突变，导致Ⅱ型胶原蛋白单倍剂量不足是导致疾病的发生原因。

2.3 家族遗传性孔源性视网膜脱离：Richards分别于2002年和2005 在多个家族遗传性孔源性视网膜脱离家系中确定该病与COL2A1基因突变有关。其中一篇文章找到一个位于COL2A1基因外显子上的突变[7-8]。而更令人感兴趣的是2003年一篇报道发现一个家族遗传性孔源性视网膜脱离家系的突变位于COL2A1基因2 号外显子上的突变[9]。而COL2A1基因2 号外显子上的突变已被多篇报道认为是与1 型Stickler综合征的基因突变紧密相关的。

2.4 其他：马歇尔综合征（Marshall 综合征）也可以导致视网膜脱离。某些病例报告其也是由COL2A1基因突变所导致的[10]。

3 COL2A1基因突变与视网膜脱离的相关研究的进展

3.1 COL2A1基因突变导致的Ⅱ型胶原蛋白单倍剂量不足理论:位于COL2A1基因上的突变导致终止密码子的提前出现，基因转录和翻译的过程提前终止，所生产的多肽链缩短，Ⅱ型胶原蛋白的生成量减少，最终导致全身结缔组织病变、眼部病变及视网膜脱离。该理论被多篇文献所证实。

例如：Ahmada于1991年发现了一个位于COL2A1上的基因突变,该突变仅针对眼部组织（全部6 名家系成员都有视网膜脱离，而全身症状相对轻微甚至于无）[3]。可以认为该突变是第一个被发现的可导致视网膜脱离的基因突变。该突变位于基因序列al-732 位点，为单个碱基突变（胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，C→T）,使氨基酸密码子由CGA转化为TGA。TGA是一个终止密码子，导致基因转录和翻译的过程提前终止，所生产的多肽链被缩短。而这种变短的多肽链是无法参与到Ⅱ型胶原纤维的合成的。显然，这种位于COL2A1基因上的沉默突变可以导致Ⅱ型胶原蛋白的生成量减少。

Ahmad随后在1995年发现了另一个Stickler综合征家系的COL2A1基因突变。该突变位于COL2A1基因的第50 号外显子上。单个碱基缺失，导致终止密码子提前出现，致使COL2A1所合成的C前肽链比正常至少减少84 个氨基酸残基，从而导致基因的功能产物不足[11]。

Korkko于1993年对一个临床表现主要为眼部症状的Stickler综合征家系(早发白内障、视网膜格子样变性、视网膜脱离)进行COL2A1基因突变关联性研究，其结论表明：该家系突变位于COL2A1基因10 号外显子，基因序列α1-67 位点上的单个碱基替换（由鸟嘌呤转化为腺嘌呤，即G→A），使密码子由甘氨酸转（GGT）变为天冬氨酸（GGT）。与其他关于研究的报道进行对比后，Korkko认为：COL2A1基因突变导致提前终止密码子的产生，是大多数Stickler综合征患者的发病机制，且该机制同时适用于眼部症状和其他系统症状[12]。

2002年Donoso,L.A.的研究小组在一个大的Stickler综合征家族（2384 名家族成员，跨度达8 代）中发现并确定了一个在COL2A1基因的2 号外显子上的C→A突变，该突变导致终止密码子的提前出现[13]。

2010年一篇文献报道[14]：一个来自欧洲的研究小组，对过去10年188 名临床诊断为Stickler综合征的患者（包括各种亚型）的COL2A1基因进行了突变扫描和双向荧光DNA测序分析。他们在其中100 名患者的COL2A1基因上找到了77 种不同的突变。分析表明这些突变基因均有异常类型RNA存在，且大多数含有提前终止密码子。在COL 2 A基因突变小组的病人中玻璃体异常和视网膜脱离较无突变小组高（P＜0.01）。其中散发的23 例COL2A1突变病人中有20 人临床表现为同时有颚裂和视网膜脱离。该研究认为当患者同时有视网膜脱离、或视网膜裂孔、或玻璃体异常，和腭裂症状，并且有阳性家族史时，往往提示患者存在COL2A1基因突变。

上述研究表明，COL2A1基因突变导致的单倍剂量不足在伴随视网膜脱离的综合征中非常普遍。

3.2 COL2A1基因突变的类型：突变导致COL2A1基因功能失活的机制据目前报道常见的主要有3 种：沉默突变、错意突变、框移突变。这3 种突变分别通过不同的分子机制导致COL2A1基因功能失活。其中又以沉默突变导致的COL2A1功能缺失最常见[14]。其他类型基因突变较少见，如2000年Richards在1 个Stickler综合征家系中发现了另一种COL2A1基因突变，这个独特的L 467 F突变可以改变Gly -XY三螺旋区域的X位置的氨基酸，导致“无胶原纤维玻璃体”[15]。

3.3 COL2A1基因不同位置突变可导致不同临床表现，位于COL2A1基因的外显子的突变多与视网膜脱离相关[8,16]。2000年Richards,A.J对8 个Stickler综合征家系和Wagner 综合征家系的研究中发现，其中3 个家系基因突变在COL2A1基因的2 号外显子上，其临床症状主要集中在眼部（包括玻璃体视网膜病变和视网膜裂孔、视网膜脱离），而全身症状很轻微甚至没有系统性症状。而其他5 个家系的突变出现在COL2A1的其他区域，症状表现为眼科症状，外加颅面部、关节、听力等方面的疾病。该结果提示：COL2A1的2 号外显子的突变可能直接导致眼部视网膜玻璃体病变[17]。

3.4 虽然已明确COL2A1基因突变可导致上述3 种综合征，但由于没有确定的基因突变位点，所以常规基因诊断仍有困难。Ahmad在1996年发明了一种利用PCR技术检测患者是否携带有COL 21 A基因突变的技术[18]。利用该技术的目的是在当某一个Stickler综合征家系的其他成员已经表现出明显的临床表现，而当其最小的婴儿尚未表现出临床症状或无法接受眼科检查时，可以利用该技术从其外周血白细胞中提取DNA，检测是否携带特定的COL2A1基因突变序列。该方法在一Stickler综合征的3 代家系研究中获得了成功。但该方法只是检测某个特定的COL2A1基因序列，而已被发现的位于COL2A1基因上与Stickler综合征相关的突变有多个，因此，该技术无法得到广泛的应用。2011年Yaguchi改进了该技术[19]，但仍然只能检测单个特定的COL2A1基因突变。

3.5 动物模型：2006年Kaarniranta的研究小组，对单个COL2A1等位基因失活的小鼠（COL2A1(+/-) mice）的眼睛进行组织学分析，发现其与人类Stickler综合征患者眼睛的结构缺陷相类似[20]。

基于这个发现，Ahmada提出一个有趣的问题：既然Ⅱ型胶原纤维在眼组织中含量很少，而在结缔组织中含量非常多，为什么这种突变却会导致严重的眼科疾病（视网膜脱离导致的严重视力缺损），而其他富含2 型胶原蛋白的组织却相对病变轻微？因此，Ahmada认为，虽然Ⅱ型胶原蛋白在眼中含量很少，但其生理功能非常重要。需要对人眼中的Ⅱ型胶原蛋白做更进一步的研究。然而，由于很难从病人的眼中提取组织，且胶原蛋白在体外的培养增殖非常困难，这个问题至今仍然没有得到很明确的解决。

3.6 COL2A1基因突变造成Ⅱ型胶原蛋白数量不足的分子机制：Snead在1996年根据其对1 型Stikler综合征的研究进行了较为合理的总结[1]：各种COL2A1基因碱基序列上的错意、删除、框移等突变，导致终止密码子的提前出现，从而导致基因的转录和翻译的重复排列的Gly-X-Y氨基酸序列缩短。这些被缩短的重复排列异常序列与正常序列形成的杂合3 聚体，在粗面内质网中无法被组装为正常的3 聚体结构(这些异常序列将会与正常序列形成杂合3 聚体)，从而导致所形成的异常蛋白质无法从粗面内质网转运到高尔基体中去。也许会有少部分这种异常结构的蛋白质会被转运到高尔基体中，但因为同样的原因仍然无法被分泌到细胞外间隙。同时还会有部分正常的Gly-X-Y氨基酸序列形成，这部分正常的氨基酸序列会沿着粗面内质网→高尔基体→细胞外间隙的正常途径在细胞外形成正常的Ⅱ型胶原蛋白。杂合3聚体与正常3 聚体的比例大概是1∶3。因而导致Ⅱ型胶原蛋白分泌的剂量不足。最终导致眼部的玻璃体视网膜病变。那些无法从粗面内质网膜表面转运出去的异常蛋白质，保存在包涵体中，最终被溶酶体所消化。

该理论较好的解释了COL2A1上的基因突变，造成Ⅱ型胶原蛋白分泌的剂量不足的病理机制。但无法解释为什么同样是Ⅱ型胶原蛋白分泌的剂量不足,在眼部的症状十分明显，而在全身其他系统（如骨骼、耳）病变较轻。

4 小结与展望

近20年来对于1 型Stikler综合征，以及可导致视网膜脱离的疾病（包括Kniest 发育障碍、家族遗传性孔源性视网膜脱离）的家系及相关基因研究，多发现视网膜脱离与编码Ⅱ型胶原蛋白的COL2A1基因突变有关。而对于其发生的具体病理机制，还需要更进一步的研究。

上述研究表明，COL2A1基因突变可导致多种遗传性视网膜脱离综合征。对大多数散发视网膜脱离患者的临床意义不大。未来可以做进一步研究，探索COL2A1基因突变与常见的散发视网膜脱离是否存在相关性。

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