蜱传森林脑炎病毒非结构蛋白1原核表达载体的构建

宋天一，李菁华，张 哲，史红艳，孙延波

（吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林 长春 130021）

＊ 吉林大学白求恩医学院临床医学七年制2006级

蜱传森林脑炎病毒（Tick－borne encephalitis virus，TBEV）是黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）成员，TBEV引起的脑炎又称森林脑炎，主要流行于欧洲和亚洲［1］，在我国主要分布于东北地区，在云南、新疆和西藏也有自然疫源地存在的报道［2］。人感染TBEV后可引起发热、头痛、意识障碍、肌肉瘫痪，可发展为致死性脑炎，病死率为5%～20%［3］。TBEV基因组为长约11000bp的单股正链RNA，由单一阅读框架编码3种结构蛋白（C、M和E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。其中，NS1为相对分子质量约40000的糖蛋白，由包膜蛋白C末端的信号肽引导分布于内质网腔，NS1在病毒复制时不可缺少，因为NS1参与病毒外源和内源性双链 RNA（dsRNA）的形成［4－5］。此外，病毒感染的患者血清中亦存在NS1蛋白，NS1蛋白可作为血清学诊断的标志。目前已知西尼罗病毒（黄病毒成员）等的NS1蛋白是1种免疫调节因子，与互补调节因子H结合后，可以抑制Toll样受体3（TLR3）信号通路［6］。本实验采用基因重组技术构建含TBEV NS1的原核表达系统，为进一步探讨TBEV的NS1在TLR3信号通路及免疫调节中的作用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 载体和感受态细胞 TBEV NS1基因由北京鼎国生物技术有限公司合成，以pMD19－T－NS1重组质粒保存于DH5α工程菌内。pEASY TM－E1表达载体、T7Promoter Primer、T7Terminator Primer和BL21感受态细胞购自北京全式金公司。

1.2 主要试剂和仪器 限制性内切酶、DNA连接酶kit购自Takara公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit购自 Tiangen公司；异丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和Ampcillin购自北京鼎国生物技术有限公司；NI－NTA resin、鼠抗HIS标签抗体和碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠二抗购自北京全式金公司。HZQ－X100振荡培养箱和高速台式离心机（RJ－TGL－16G）购自北京鼎国生物技术有限公司；分光光度计（2800UV／VIS UNIK）购自美国GE公司；数码凝胶图像系统（GIS－2008）购自美国Biometra公司。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank中登录的TBEV NS1基因序列（AY182009）设计引物，引物由华大基因公司合成。为构建表达载体，在上、下引物的5′端分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位点。NS12329：5′－TGCGAATTCGATGTTGGCTGTGCTGTGGA－3′；NS13384：5′－GAACTCGAGTGCCACTACCATTGAGCGAACA－3′（下划线处为酶切位点）。

1.4 目的基因的扩增 利用合成的引物，以质粒pMD19－T－NS1为模板，采用PCR技术扩增目的基因NS1，扩增条件为94℃、3min，94℃、30s，68℃、30s，72℃、60s，30个循环后 ，72℃延伸10min。

1.5 原核表达重组质粒pEASYTM－E1－NS1的构建 将NS1的PCR产物与表达载体pEASY TME1相连（目的片段与质粒载体的比例为7∶1），连接产物转化感受态细胞DH5α。挑取单克隆DH5α于10μL无菌水，取1μL混合于25μL PCR体系中。采用T7Promoter Primer和目的基因反向引物或用目的基因正向引物和T7Terminator Primer鉴定正确表达方向的阳性重组质粒。提取连接正确的阳性重组质粒并进行EcoRⅠ 和XhoⅠ 双酶切鉴定，利用T7Promoter Prime和T7Terminator Primer测序。

1.6 重组蛋白His－NS1的诱导表达与纯化 将测序正确的重组质粒pEASY TM－E1－NS1转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，经0.5mmol·L－1于IPTG于37℃诱导表达后，取菌液离心收集菌体沉淀，进行10%SDS－PAGE分析，确定目的蛋白的表达。取上清液500mL行扩大培养，经IPTG诱导表达4h后，4℃、5000r·min－1离心10min，将沉淀重悬后超声破碎，4℃、12000r·min－1离心30min，取适量上清和沉淀进行10%SDS－PAGE分析。超声破碎细菌后将包涵体经1%Triton X－100洗2次，以10mL（8mol·L－1）尿素重悬，室温过夜。用0.45μm滤器过滤除去杂质。采用Ni－NTA树脂层析柱纯化蛋白，将蛋白样品上样于Ni柱，流速60滴·min－1，回收流出液，用5倍体积包涵体溶解液洗柱，3倍体积的20mmol·L－1咪唑洗脱杂蛋白，最后用3倍体积的500mmol·L－1咪唑洗脱目的蛋白。

1.7 重组蛋白His－NS1的 Western blotting分析将纯化后的重组蛋白进行SDS－PAGE电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上、封闭，用鼠抗His标签抗体作为一抗，AP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，BCIP／NBT显色。将经纯化后的蛋白稀释1倍，采用Bradford法测定蛋白浓度。利用标准品绘制标准曲线后，得出待测蛋白的浓度。用超滤管（相对分子质量为10000以下的蛋白被滤除）浓缩蛋白。

2 结 果

2.1 目的基因的扩增 根据TBEV NS1基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，获得1条长度约为1056bp的基因片段，与预期片段大小一致。见图1。

图1 TBEV NS1基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of TBEV NS1gene

2.2 原核表达重组质粒pEASYTM－E1－NS1的鉴定 由于表达载体pEASYTM－E1由pET载体改造而成，克隆的PCR产物有正向和反向2种。T7 Promoter Primer和目的基因反向引物通过PCR技术得到长度约为1200bp的基因片段（图2），该片段包括T7Promoter Primer至目的基因起始端的142bp和1056bp的目的基因。说明克隆的目的基因为正向连接。提取阳性重组质粒用EcoRⅠ及XhoⅠ 双酶切得到长度为5715bp的载体条带和长度为1056bp的目的条带（图3），进一步明确目的基因片段成功克隆至pEASYTM－E1表达载体。利用BLAST软件分析重组质粒的序列并与GenBank中相应的核苷酸序列进行比较，结果显示其同源性为100%。

2.3 重组蛋白His－NS1的表达和纯化 含重组质粒的细菌（pEASY TM－E1－NS1）经IPTG 诱导后，将细菌离心、煮沸，进行SDS－PAGE分析，在相对分子质量约40000处出现特征性表达带，而未诱导菌未见该特征性表达带（图4）。为进一步鉴定重组蛋白His－NS1的表达形式，通过超声破碎裂解含重组质粒的细菌，对上清和沉淀进行SDS－PAGE，电泳结果显示重组蛋白 His－NS1主要以包涵体形式存在于细菌中，而细菌培养物的上清中则无重组蛋白His－NS1（图5）。将超声破碎裂解后所得菌体沉淀 （包括包涵体）用含8mol·L－1尿素的裂解液溶解后，利用镍离子亲和层析柱纯化，再利用咪唑洗脱特异结合的蛋白，经10%SDS－PAGE分析表明，纯化的表达产物在相对分子质量约40000处显示出1条杂交蛋白带（图6）。将经纯化的蛋白稀释1倍，采用Bradford法测定蛋白浓度，绘制标准曲线，测得待测蛋白平均吸光度（A）值为0.140，根据标准曲线，得出待测蛋白的浓度约为220mg·L－1。采用超滤管为浓缩蛋白，经PBS重悬，最终获得浓度为5g·L－1的重组蛋白溶液。

图2 重组质粒pEASYTM－E1－NS1的鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pEASYTME1－NS1

图3 重组质粒pEASYTM－E1－NS1的双酶切分析Fig.3 Analysis of recombinant plasmid pEASYTM－E1－NS1 digested by restrictive endonuclease

2.4 重组蛋白His－NS1的 Western blotting分析SDS－PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭，以鼠抗His标签抗体作为一抗，AP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western blotting分析，在相对分子质量约40000处可见1条蛋白杂交带，表明重组蛋白His－NS1能与特异的抗体反应（图7）。

图4 超声裂解前细菌表达产物的SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis of fungus expression product before ultrasound cracking

图5 超声裂解后细菌表达产物的SDS－PAGE分析Fig.5 SDS－PAGE analysis of fungus expression product after ultrasound cracking

图6 重组蛋白His－NS1的纯化Fig.6 Purification of recombinant protein His－NS1

图7 重组蛋白His－NS1的Western blotting分析Fig.7 Western blotting analysis of recombinant protein His－NS1

3 讨 论

TBEV所引起的脑炎一般呈现2个感染阶段［7］，在感染早期患者有发热、四肢无力、肌肉疼痛和伴有皮疹，随着病情的发展出现高热、头痛、恶心呕吐和脑炎或脑膜炎的临床表现，儿童患病的死亡率较高。TBEV和黄病毒的其他成员一样，借助包膜E蛋白感染靶细胞受体，病毒穿入细胞内释放病毒基因组，病毒开始大量复制并在细胞内质网和高尔基体中成熟，最后从细胞内释放并影响和破坏细胞的功能［8］。虽然TBEV感染机体后可诱发体液免疫和细胞免疫，但病毒和抗体结合后通过免疫球蛋白Fc段受体被巨噬细胞吞噬非但不能灭活病毒，且可使病毒在巨噬细胞内长期存在。另一方面，RNA病毒的多聚酶不具有自我修正功能，往往导致病毒E蛋白抗原的变异［9］，是病毒形成免疫逃逸的机制之一。现已明确，西尼罗病毒（黄病毒成员）的NS1蛋白能抑制干扰素基因的转录［10］，其机制是通过TLR3信号途径阻断β－干扰素的转录活化以及通过IRF3或NF－κB抑制IL－6的转录。登革病毒（黄病毒成员）的非结构蛋白（NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS4B）可以通过JAK／STAT信号途径［11－12］抑制干扰素的合成。而TBEV NS1在TLR3信号通路和干扰素合成抑制方面的研究未见报道。本研究利用基因工程方法构建了NS1基因表达载体pEASYTM－E1－NS1，为研究TBEV NS1的多样生物学功能提供实验基础。

pEASY TM－E1表达载体是由pET载体改造而成，可以在很短的时间内利用TA克隆技术克隆PCR产物，无需中间TA克隆技术环节，因此TBEV NS1的PCR产物直接连接至pEASY TME1表达载体，转染至感受态细胞后可进行目的基因表达。为确认正确表达方向的阳性重组质粒，利用T7Promoter Primer和目的基因反向引物通过PCR方法，同时采用限制性酶切分析阳性重组质粒，确定PCR产物的连接为正向连接。本文作者将含有TBEV NS1的表达载体（pEASY TM－E1）转染至大肠杆菌进行目的基因的表达。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩展至真核细胞（如酵母细胞、昆虫、植物和哺乳动物细胞），但是大肠杆菌仍然是基因表达的有效工具。本研究旨在获得目的蛋白在原核细胞中的高效表达，而目的蛋白的表达受多种因素（诱导时间、诱导剂的浓度和温度等）的影响，本文作者最终确认最佳的表达条件是：IPTG浓度为0.5mmol·L－1，37℃诱导4h。经超声处理后，细菌包涵体通过变性，上清经镍离子亲和层析柱纯化再利用咪唑洗脱特异结合的蛋白，最后采用超滤管（相对分子质量10000以下的蛋白被滤除）浓缩蛋白，经PBS重悬，最终获得浓度为5g·L－1的重组蛋白溶液。高浓度TBEV NS1的获得，为进一步研究其多样的生物学功能奠定了基础。

［1］杨正时﹒TBEV传播的生态链 ［J］.中国微生态学杂志，2012，24（1）：76－79.

［2］王 丹，康晓平，郝淮杰，等.TBEVTBE－E－D3抗原的原核表达纯化及ELISA方法鉴定 ［J］.生物技术通讯，2011，22（5）：636－639.

［3］Poponnikova TV.The clinical picture of tick－born encephalitis in children［J］.Int J Med Microbiol，2008，298（1）：351－355.

［4］Suss J.Epidemiology and ecology of TBE relevant to the production of effective vaccines［J］.Vaccine，2003，21（3）：19－35.

［5］Rendi－Wangner P.Advances in vaccination against tick－borne encephalitis［J］.Expert Rev Vaccinecs，2008，7（5）：589－596.

［6］Wang T，Town T，Alexopoulou L，et al.Toll－like receptor 3mediates West Nile virus entry into the brain causing lethal encephalitis［J］.Nat Med，2004，10（12）：1366－1377.

［7］Dumpis U，Crook D and Okis J.Tick－born encephalitis［J］.Clin Infect Dis，1999，28（4）：882－890.

［8］Welsch S，Miller S，Romero－Brey I.Composition and threedimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites［J］.Cell Host Microbe，2009，5（4）：365－375.

［9］Ye J，Zhu B，Fu ZF，et al.Immune evasion strategies of flaviviruses［J］.Vaccine，2013，31（3）：461－471.

［10］Wilson JR，de Sessions PF，Leon MA，et al.West Nile virus nonstructural protein 1inhibits TLR3signal transduction［J］.J Virol，2008，28（17）：8262－8271.

［11］Takaoka A，Yanai H.Interferon signaling network in innate defence［J］.Cell Microbiol，2006，8（6）：907－922.

［12］Jones M，Davidson A，Hibbert L，et al.Dengue virus inhibits alpha interferon signaling by reduced STAT2 expression［J］.J Virol，2005，79（9）：5414－5420.