血管内皮钙黏蛋白在非小细胞肺癌血管生成中的作用

陶 韬，陈 虹，顾雪霜，周俊豪，彭单伊，张丽君（重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆 400016）

血管生成是肿瘤生长、浸润和转移的必要条件，抗血管生成疗法成为治疗肿瘤的新策略。目前已发现许多因子参与血管的生成与调控，其中血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial－cadherin，VE－cadherin）是特异性表达于血管内皮细胞的一类细胞黏附分子，在血管形成过程中必不可少［1］。VE－cadherin与多种恶性肿瘤血管生成相关，但在非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）中的研究尚少。本课题组前期研究［2］显示：VE－cadherin在NSCLC组织中的表达明显高于正常组织，且在癌细胞中大量表达，但其是直接对癌细胞起作用还是对血管内皮细胞起作用尚不清楚。本研究采用RNA干扰技术，沉默肺癌细胞中VE－cadherin的表达，并观察VE－cadherin对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的影响，为NSCLC的抗血管生成治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂及仪器 人肺癌细胞株A549由本实验室保存，HUVECs购自中南大学湘雅医学院。DMEM培养基、RPMI－1640培养基和胎牛血清均购自Gibco公司；TRIzol试剂、Primscript RT reagent Kit试剂盒、SYBR Premix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒均购于TaKaRa公司；兔抗VE－cadherin购自Abcam公司；MTS试剂购自Promega公司；Matrigel胶购自BD公司；Lipofectamin RNAi MAX Reagent购自Invitrogen公司；AnnexinⅤ－FITC凋亡检测试剂盒购自Sigma公司；细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；人VE－cadherin－双抗夹心ELISA试剂盒购自上海沪尚生物工程有限公司；Western blotting相关试剂购自碧云天公司；RNA干扰序列［3］：正义链，5′－GGAACCAGAUGCACAUUGAUU－3′；反义链，5′－UCAAUGUGCAUCUGGUUCCUU－3′；NC－siRNA 由上海吉玛制药技术有限公司合成；VE－cadherin引物：上游，5′－TTTCCAGCAGCCTTTCTACCA－3′； 下游，5′－GGAAGAACTGGCCCTTGTCA－3′，扩增产物长度为145bp；GAPDH引物：上游，5′－ACCTGACCTGCCGTCTAGAA－3′；下游，5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′，扩增产物长度为227bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 细胞培养和转染 人肺癌细胞株A549用含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2条件下培养，转染前l d换新鲜培养液。采用RNAi MAX脂质体转染反转录法，细胞分为空白对照组、干扰组和阴性对照组，各组细胞均加500μL Optimer和5μL RNAi MAX，干扰组细胞另加入1.5μL VE－cadherin－siRNA ，阴性对照组细胞另加入1.5μL NC－siRNA，混匀，室温静止20min后，每孔接种2×104细胞于6孔板中，6h后换液。HUVECs分为干扰组和阴性对照组，用含10%FBS的RPMI－1640培养基，置于37℃、5%CO2条件下培养。

1.3 实时定量PCR法检测 VE－cadherin mRNA表达水平 转染48h后，采用TRIzol法提取RNA，将逆转录产物cDNA稀释20倍，逆转录体系及条件、扩增体系均按说明书进行，扩增条件：95℃预变性5min后，95℃、10s，55℃、30s，共40个循环，65℃、5s。独立重复实验3次。

1.4 Western blotting法检测VE－cadherin蛋白表达水平 转染72h后，常规方法提取细胞总蛋白，取蛋白提取物40μg进行SDS－PAGE电泳。在250mA电流下，转膜100min，封闭1h，兔抗VE－cadherin（1∶1000稀释）4℃过夜，TBST 洗5min×5次，与二抗在室温下反应1h，TBST洗5min×5次，ECL法显影。同时，以GAPDH（1∶800稀释）为对照。独立重复实验3次。

1.5 新型四唑氮盐（MTS）比色法检测VE－cadherin作用后A549细胞增殖情况 转染12h后重悬细胞，调整细胞密度为2×104mL－1，每孔100μL接种于96孔板，以此时为0h，分别于0、24、48和72h加入10μL MTS，孵育1h，酶标仪测定各孔于490nm处的光密度（A490）值，每个时间点每组设5个复孔。独立重复实验3次。

1.6 流式细胞术检测VE－cadherin作用后A549细胞周期和凋亡率 转染48h后，收集细胞，采用流式细胞术检测VE－cadherin对A549细胞周期、凋亡的影响，操作步骤按照试剂盒说明书进行。独立重复实验3次。

1.7 ELISA法检测各组 A549细胞上清液VE－cadherin表达水平 细胞转染72h后取上清液，采用人VE－cadherin－双抗夹心ELISA检测试剂盒进行检测，操作按说明书进行。检测各组上清液的A490值，根据标准曲线得出VE－cadherin表达水平。独立重复实验3次。

1.8 MTS比色法检测VE－cadherin作用后HUVECs增殖情况 重悬HUVECs至密度为1×104mL－1，每孔100μL接种于96孔板，6h后干扰组和阴性对照组分别加上清液100μL，以此时为0h，分别于0、24、48和72h加入20μL MTS，酶标仪测定各孔A490值，每个时间点每组设5个复孔。细胞增殖抑制率＝（1－干扰组A490值／阴性对照组A490值）×100%。独立重复实验3次。

1.9 流式细胞术检测VE－cadherin作用后HUVECs周期和凋亡率 将8000个／孔HUVECs接种于6孔板，第2天用PBS洗2遍，1∶1加入含10%FBS的RPMI－1640培养基和收集的上清液共2mL。48h后采用流式细胞术检测VE－cadherin对HUVECs周期和凋亡的影响，操作步骤按照试剂盒说明书进行。独立重复实验3次。

1.10 小管形成实验 将Matrigel胶在4℃溶解过夜，用无血清的DMEM培养液稀释Matrigel（1∶1）后，50μL铺于预冷的96孔板中，聚合1h；消化 HUVECs，1000r·min－1离心5min，将干扰组、阴性对照组上清液分别重悬细胞并调整密度至8×105mL－1，50μL种板，6h后200倍倒置显微镜下观察并照相。每组5个随机视野计数小管形成数，取平均值。独立重复实验3次。

1.11 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，VE－cadherin的表达水平、细胞A490值、各细胞周期细胞所占比例、细胞凋亡率和小管形成数均以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组细胞VE－cadherin的表达水平 干扰组细胞VE－cadherin mRNA表达水平（0.299±0.039）明显低于空白对照组（1.137±0.082）和阴性对照组（1.001±0.076）（P＜0.05），干扰组较空白对照组和阴性对照组表达水平下调约70%；Western blotting法检测，干扰组细胞的蛋白表达水平（0.297±0.045）明显低于空白对照组（0.833±0.119）和阴性对照组（0.794±0.095）（P＜0.05）（图1），而空白对照组和阴性对照组VE－cadherin mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 VE－cadherin基因沉默后A549细胞增殖情况在0、24、48和72h各组细胞间的A490值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 VE－cadherin基因沉默后A549细胞周期和细胞凋亡 转染48h后，空白对照组、干扰组和阴性对照组A549细胞在G0／G1、G2／M和S期所占百分比比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。3组 A549细胞凋亡率分别为（11.99±4.77）%、（13.71±4.79）%和（12.02±4.25）%，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组A549细胞中VE－cadherin蛋白的表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of expressions of VE－cadherin of A549cells in various groups Lane 1：Blank control group；Lane 2：Interference group；Lane 3：Negative control group.

2.4 A549细胞上清液中VE－cadherin的表达水平转染72h后，干扰组上清液中VE－cadherin的表达水平 ［（2.89±0.07）μg·L－1］明显低于空白对照组 ［（11.43±0.09）μg·L－1］和阴性对照组［（11.15±0.04）μg·L－1］（P＜0.05），而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 VE－cadherin作用后HUVECs增殖情况 干扰组与阴性对照组上清液比较，A490值在24、48和72h明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。干扰组24、48和72h细胞增殖抑制率分别为29.2%、33.8%和30.1%。

表1 MTS法检测VE－cadherin作用后A549细胞的A490值Tab.1 A490values of A549cells after treated with VE－cadherin detected by MTS method （）

表1 MTS法检测VE－cadherin作用后A549细胞的A490值Tab.1 A490values of A549cells after treated with VE－cadherin detected by MTS method （）

0.89±0.05 Negative control 0.32±0.01 0.43±0.01 0.59±0.01 0.77±0.02 Interference 0.32±0.02 0.41±0.01 0.52±0.010 24 48 72 Blank control 0.33±0.01 0.43±0.02 0.65±0.03 Group A490value（t／h）0.75±0.02

表2 VE－cadherin作用后各组A549细胞周期的变化Tab.2 Changes of cell cycles of A549cells after treated with VE－cadherin in various groups ［η／（）%］

表2 VE－cadherin作用后各组A549细胞周期的变化Tab.2 Changes of cell cycles of A549cells after treated with VE－cadherin in various groups ［η／（）%］

09 Negative control 58.33±6.19 9.64±3.52 32.03±3.18 Interference 60.72±4.17 7.89±1.62 31.39±3.M S Blank control 59.30±3.97 8.11±2.11 32.50±2.Group Percentage of A549cells G0／G1 G2／45

表3 VE－cadherin作用后HUVECs增殖的改变Tab.3 Changes of proliferation of HUVECs after treated with VE－cadherin （）

表3 VE－cadherin作用后HUVECs增殖的改变Tab.3 Changes of proliferation of HUVECs after treated with VE－cadherin （）

＊ P＜0.05compared with negative control group.

Group A490 0.91±0.92 Interference 0.27±0.02 0.37±0.04＊ 0.54±0.04＊ 0.64±0.030 24 48 72 Negative control 0.26±0.02 0.52±0.02 0.82±0.01 value（t／h）＊

2.6 VE－cadherin作用后HUVECs周期和凋亡率 VE－cadherin作用48h后，干扰组与阴性对照组各细胞周期（G0／G1、G2／M 和S）HUVECs所占百分比比较差异无统计学意义（P＞0.05）。干扰组和阴性对照组上清液中HUVECs凋亡率分别为（27.12±5.22）%和（13.43±3.50）%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4和图2。

2.7 VE－cadherin作用后HUVECs小管形成数将干扰组和阴性对照组上清液分别重悬HUVECs，6h后观察小管形成情况，干扰组细胞聚集减少，完整管腔数目明显减少，干扰组和阴性对照组小管形成数量分别为1.53±0.31和14.53±1.51，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

表4 VE－cadherin作用后HUVECs周期的变化Tab.4 Changes of cell cycles of HUVECs after treated with VE－cadherin ［η／（）%］

表4 VE－cadherin作用后HUVECs周期的变化Tab.4 Changes of cell cycles of HUVECs after treated with VE－cadherin ［η／（）%］

Group Percentag.04 Interference 42.54±2.52 9.49±3.10 47.98±2.M S Negative control 41.94±2.48 11.53±4.66 46.53±4 e of HUVECs G0／G1 G2／42

图2 VE－cadherin作用后HUVECs凋亡的改变Fig.2 Changes of the apoptosis of HUVECs after treated with VE－cadherin

图3 VE－cadherin作用后HUVECs的小管形成Fig.3 Tubule formation of HUVECs after treated with VE－cadherin

3 讨 论

血管生成在肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥着至关重要的作用，丰富的血管可以不断地向肿瘤组织提供氧气和营养，并排出肿瘤细胞的代谢产物；同时其远处转移也必须以血管新生为前提和必要条件。目前新的观点认为：血管生成抑制剂还可使肿瘤血管正常化，即使异常的血管在结构和功能上趋于正常。而肿瘤血管和微环境异常是肿瘤化疗和放疗耐受的主要原因，即使用血管生成抑制剂可以提高传统化疗和放疗的疗效。

VE－cadherin是特异性表达于血管内皮细胞的一类细胞黏附分子，定位于内皮细胞与内皮细胞连接处，在维持和控制内皮细胞连接方面起重要作用，且在血管形成过程中必不可少［1］。VE－cadherin氨基端与相邻血管内皮细胞上相同的VE－cadherin同嗜黏附，其羧基末端与2个胞内蛋白β－catenin和γ－catenin相连，2个胞内蛋白属于Armadillo家族，其通过α－catenin将 VE－cadherin与肌动蛋白细胞骨架相连，保证了血管的完整性。新近的研究［4－9］显示：VE－cadherin与肾母细胞瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、结肠癌和卡波氏肉瘤等多种恶性肿瘤血管生成关系密切，是乳腺癌转移新的生物标志物。但目前国内外，VE－cadherin与肺癌的关系鲜见报道，仅Dome等［10］研究显示：与健康者比较，NSCLC患者外周血中 VE－cadherin mRNA表达水平并未显著增加。Liao等［11］应用VE－cadherin的抗体阻断VE－cadherin介导的同嗜黏附作用，可以抑制裸鼠皮下种植的Lewis肺癌细胞和人A431上皮癌细胞的生长和转移。然而，肺癌是最常见的恶性肿瘤，全球发病率和死亡率居癌症首位，临床多数肺癌发现时已属中、晚期，其5年生存率不到15%，而其中75%～80%为NSCLC。现有资料未能全面阐述NSCLC血管生成的机制，故有必要寻找新的与NSCLC血管生成相关的基因以进一步完善其发病机制。

本研究前期研究显示：VE－cadherin在NSCLC组织中的表达明显高于正常组织［2］，且在癌细胞中大量表达，这促使本文作者猜想VE－cadherin可能参与了NSCLC的发生发展，但是直接对癌细胞起作用还是对血管内皮细胞起作用尚不清楚。本研究利用RNA干扰技术，有效抑制了VE－cadherin在A549细胞中的表达，尚未发现其对A549细胞增殖、周期和凋亡有影响，干扰组细胞上清液中VE－cadherin表达水平明显低于空白对照组和阴性对照组，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义，故后续实验仅研究干扰组和阴性对照组。本研究结果显示：干扰组和阴性对照组上清液对HUVECs增殖、凋亡率和周期变化无影响，表明VE－cadherin对HUVECs有促增殖和抗凋亡作用；本研究结果显示：干扰组HUVECs聚集及形成完整管腔数明显减少，表明VE－cadherin在完整血管管腔的形成过程中起重要作用。以上结果表明：癌细胞为了生长大量合成并分泌VE－cadherin，VE－cadherin促进血管生成，反过来又促进肿瘤生长，这为NSCLC的抗血管生成治疗提供了新的靶点。

VEGF是目前已知的活性最强、特异性最高的内皮细胞促有丝分裂细胞因子，其他的血管生成因子也通过VEGF而起作用。VEGF可促使Rac1依赖性活性氧（ROS）的生成，导致 VE－cadherin Y658和Y731磷酸化，进一步导致细胞间连接的分离和单分子层渗透性增加［12］。Gavard等［13］认为：VEGF通过Src依赖的VaV2磷酸化激活小GTP酶Rac，Rac又促进由PAK介导的VE－cadherin S665磷酸化，引起β－arrestin募集到VE－cadherin上，导致 VE－cadherin内化。血管内皮－蛋白酪氨酸磷酸酶（VE－PTP）加强了VE－cadherin介导的细胞间黏附，VE－cadherin／VE－PTP复合体的分离是白细胞渗出和VEGF诱导的血管渗透性增加所必须的［14］。VEGF诱导VE－cadherin正向连接在鼠肺或睾提肌血管内皮细胞重新排列，这依赖于TSAD，其在内皮细胞连接处与 VE－cadherin、VEGFR2和c－Src形成复合体［15］。总之，VE－cadherin酪氨酸和丝氨酸磷酸化直接影响了VE－cadherin的稳定，从而影响其内皮渗透性，但其具体机制还有待进一步研究。

综上所述，VE－cadherin通过促进血管生成来参与NSCLC的发生发展，有望成为NSCLC抗血管生成治疗的新靶点。因此，本文作者设想通过抑制VE－cadherin的异常表达，进一步抑制NSCLC的生长、浸润和转移，从而改善患者的预后，为NSCLC的靶向治疗提供一个新的靶点。

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