一株萘降解菌的分离及其在石油降解中耐盐性的研究

辛树权，刘海音，沈 勇

（长春师范学院生命科学学院，吉林长春 130032）

随着工业的发展，石油在给人们带来巨大的经济效益的同时，对环境造成了极大的威胁。由于油田采出液不仅含有石油，也含有高浓度的盐分，因此，采油现场附近发生溢漏会使土壤受到油和盐的双重污染[1]。目前石油污染已成为全世界各国亟待解决的问题，研究人员都在积极寻找治理石油污染的有效途径。利用物理或化学方法处理石油污染物可以得到较好的效果，但成本高及二次污染等问题使其应用受到了限制。作为一种环境友好替代技术，石油污染土壤的生物修复已受到更多相关领域研究者的重视[2]。微生物修复以其高效、经济和无二次污染等诸多优点而成为近些年来主要处理石油污染土壤的方法，但微生物修复仍然存在着一定的局限性，因此微生物修复技术还需更深入的研究[3-5]。

石油的主要组成部分是由碳氢化合物形成的烃类，约占石油组分的95%～99%，其中烃类化合物有烷烃、环烷烃、芳香烃，此外还有40多种微量的金属元素，如钠、钾、钙、镁等，其中钠约占75%[3-6]。本文的研究是关于以含有两个苯环的多环芳烃萘为唯一碳源从被石油副产品污染的土壤中分离出的纯菌株，在不同pH和不同盐浓度下菌株的生长情况以及该菌对石油降解性能的研究，同时也为石油污染的微生物修复提供新的菌种资源和信息。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

长春二道区中国石油东环城路加油站附近被石油副产品污染的土壤。

1.1.2 主要试剂与仪器

萘（上海中国远航试剂厂），恒LD4-2离心机，T6新悦-可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 萘降解菌株的分离和培养

使用以萘为惟一碳源(200mg·L-1)的无机盐培养基：MgSO4·7H2O 0.02g，NH4NO31.00g，KH2PO40.40g，Na2HPO4·3H2O 0.60g，MnSO4·H2O 0.02g，CaCl·2H2O 0.02g，FeSO4·7H2O 0.01g[5]，加蒸馏水定容至 1000 ml，萘200mg/L，pH值7.0。

萘用正己烷溶解配制成200 mg·L-1的萘试剂加入到培养基中。

1.2.2 分离筛选培养基

无机盐固体培养基，无机盐培养基中加入琼脂20g。

1.3 土壤中萘降解菌株的分离

土壤用100目的筛子过滤，除去大的杂质颗粒，然后取1 g土壤制备成土壤溶液，静止后取稀释液0.1ml涂布于含萘的分离培养基上；封好涂布后的平板，30℃恒温培养箱倒置培养3 d～5 d；从平板中挑出生长好的典型菌落，在含萘固体培养基上反复划线培养，直到得到形态一致的纯化菌落。

1.4 不同因素对菌株生长及菌株降解石油效率的影响

1.4.1 菌悬液和石油原液的制备

菌悬液的制备：挑取降解菌株，接种在TSB液体培养基中，在30℃165r/min摇床振荡培养1天离心后，制备成菌悬液备用。

石油原液的制备：取10ml石油原液，加入90ml的石油醚，在60℃~90℃的水浴锅中加热溶解，制备成10%的石油原液后待石油醚挥发尽后备用。

1.4.2 培养液中原油萃取的方法

将培养7天后的摇瓶培养液全部倾入250ml的分液漏斗中，加入适量石油醚，加盖充分振荡2min，期间要注意放气，静止分层后，弃去下层液体。用适量石油醚将摇瓶中剩余的石油充分溶解后也倒入分液漏斗中，加盖充分振荡，注意放气。静止待液体充分分层后，弃去下层液体。将上层石油醚萃取液经用塞少许脱脂棉，上面放2g无水硫酸钠的漏斗过滤。滤液放入事先洗净烘干至恒重称量后的锥形瓶中。再用少许石油醚冲洗摇瓶，将液体倒入分液漏斗中，重复前面的操作，直到摇瓶中的石油被抽提干净为止。然后将装有抽提液的锥形瓶置于恒温水浴锅中在60℃左右的温度下于通风橱中蒸干石油醚溶剂，干燥至恒重后称量[7-10]。

降解率计算式：

降解率=1-(W1-W2)/W0×100%，

W0为初始原油质量（g），W1为锥形瓶+样品中残油的质量（g），W2为锥形瓶的质量（g）。

1.4.3 菌液的OD600处的吸光度值测定

取培养7天后的培养液（摇均匀）于比色皿中置于分光光度计中测定OD600处的值。

1.4.4 不同pH值对菌株的生长及菌株降解石油效率的影响

在50ml锥形瓶中加入25ml的无机盐培养基并调节pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0，然后分别在pH值不同的锥形瓶中加入2.5ml 10%的石油溶液，使得培养基中石油的终浓达到1%，接种制备好的菌悬液250ul，在30℃、165r/min摇床培养7天后，测菌液在OD600处的吸光度值，并用重量法测定石油的降解率。

1.4.5 不同盐浓度对菌株的生长及菌株降解石油效率的影响

在50ml锥形瓶中加入25mlpH为7.0的无机盐培养基，并分别加入2.5ml的1 g·L-1、3 g·L-1、5 g·L-1、7 g·L-1的NaCl溶液，然后分别在盐浓度不同的锥形瓶中加入2.5ml 10%的石油溶液，使得培养基中石油的终浓达到1%，接种制备好的菌悬液250ul，在30℃、165r/min摇床培养7天后，测菌液在OD600处的吸光度值，并用重量法测定石油的降解率。

2 结果与分析

2.1 分离筛选的萘降解菌菌落的形态特征

经富集、分离获得能以萘作为唯一碳源和能源生长的一株菌株，观察菌落的形态特征（图1）。菌落呈淡黄色、圆形、光滑突起、饱满、边缘整齐的形态并且易挑取。

图1 平析中耐盐性菌落的形态的光学显微镜照片

2.2 不同因素对菌株生长及菌株降解石油效率的影响

2.2.1 pH值对菌株生长及对菌株降解石油效率的影响

pH值会影响降解酶的空间构象，pH值的变化对酶活性的挥发有一定的影响。pH值还能调节菌体细胞对培养基质的利用速度和细胞的状态，从而改变菌体的生长速度和微生物细胞的代谢途径。通常微生物只能在特定的PH值范围内生长，该范围的宽窄可在一定程度上反映微生物对环境适应能力的强弱[11]。

图2 不同pH对菌株生长的影响

图3 不同pH对菌株降解石油效率的影响

如图2所示，pH值对菌株的生长具有显著的影响。在pH值为5~7之间时，菌株的生长呈上升趋势，并且pH为7时生长值达到最大，随着pH值的继续升高，菌株的生长状况又有所下降。pH对菌株降解石油的效率也有很大的影响，如图3所示，当pH值为7时，降解率可达21.79%，此后随着pH值继续升高，菌株的生长受到抑制，对石油的降解率也随之下降。这说明中性环境更有利于萘降解菌的生长，能更有效地降解石油。

2.2.2 盐浓度对菌株生长及对菌株降解石油效率的影响

盐胁迫对菌体的的毒害作用包括两个方面：其一是产生离子毒害，在菌体内积累Na+，其二是产生渗透胁迫，使质膜的跨膜片渗透压降低而导致细胞膨压的丧失[12]。菌体细胞主要通过学习Na+的外流、Na+在囊泡中的区隔化、增加质膜K+的吸收而限制Na+的吸收、调节相容性渗调剂和渗透保护剂的合成和积累，以及胁迫蛋白的表达对盐胁迫产生应答[13-14]。

图4 不同NaCl浓度对菌株生长的影响

图5 不同NaCl浓度对菌株降解石油效率的影响

如图4所示，菌株在NaCl质量浓度为3 g·L-1以下时生长良好，而大于此浓度时，菌体会因不同程度的失水，使生长菌株生长受到抑制。如图5所示，当NaCl浓度为3g·L-1时，对石油的降解效率较高，可达15.98%。当NaCl质量浓度为7 g·L-1时，对石油的降解率仅为9.67%。这说明NaCl浓度对石油的降解率有直接影响，浓度高使石油降解菌的生长受到了抑制，也间接的使石油降解率下降。

3 结论与讨论

从长春二道区中国石油东环城路加油站附近挖取的被石油副产品污染的土壤中分离筛选出的一株以萘为唯一碳源的萘降解菌，对菌落进行形态学观察，观察到菌落呈淡黄色、圆形、光滑突起、饱满、边缘整齐的形态。通过研究不同pH和不同浓度的NaCl溶液对该菌生长情况的影响以及该菌对石油降解效率的影响后得出，该菌对石油具有优良的降解性，在温度30℃、转速165r/min、pH值为7、NaCl质量浓度3g·L-1条件下降解性能最佳。

选择适度的石油降解耐盐菌对于环境保护具有重要作用。由于在石油开采中，原油为一种混合物，本身就带着一定的盐份，不仅对管道造成不同程度的腐蚀，同时也对土壤造成了一定的盐害。以前我们往往用物理的或化学的手段来对落地原油进行处理，但是在修复环境的同时也对环境造成了二次污染。生物处理法是近年来发展起来的处理石油污染比较好的一种方法，具有处理效果好、费用低、对环境污染小、无二次污染及应用范围广等优点。而应用微生物来治理石油烃类物质的污染，较物理或化学方法成本较低，投资少，效率高，因此越来越受到普遍重视[15-16]。

我们选择的耐盐菌株添加到受污染的土壤中，可以提高原土壤中原油的降解速度，加大降解率。同时耐盐菌还可以减轻植物盐害，增大植物的生长量，间接地对环境起到修复作用。

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