ApoG2联合紫杉醇对鼻咽癌细胞及其移植瘤的抑制作用观察

钟 梅，汪森明，石丰榕，朱震威

(南方医科大学附属珠江医院，广州510282)

鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势［1］，尽管近年来其治疗有较大进展，但肿瘤转移或治疗后复发率仍较高。Apogossypolo ne(ApoG2)是棉酚的一种新型衍生物，具有抗肿瘤活性高、毒性小、稳定性好的特点［2］。紫杉醇(PTX)从紫杉树皮中提取，是作用于细胞微管的主要抗肿瘤药物之一，对多种肿瘤有明显疗效。近期我们观察了ApoG2联合PTX对人鼻咽癌CNE-2细胞及其移植瘤的抑制作用，并初步探讨其可能机制，旨在为鼻咽癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Balb/c-nu裸鼠由广东省实验动物中心提供，4～6周龄，体质量16～20 g，雌雄不拘，在无特定病原体(SPF)条件下饲养。动物质量和环境设施合格证号分别为:SCXK(粤)2008-0002、SYXK(粤)-2007-0081。人鼻咽癌CNE-2细胞株由南方医科大学肿瘤研究所细胞中心提供(采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养)。ApoG2由美国密歇根大学医学院肿瘤中心徐梁教授惠赠。PTX购自海南中化联合制药有限公司。兔源Bcl-2多克隆抗体为美国CST公司产品，兔SP检测试剂盒(SP-9000)、DAB显色试剂盒(ZLI-9031)、AP标记山羊抗兔IgG均购自北京中杉公司。其余试剂为国产分析纯。

1.2 ApoG2、PTX对CNE-2细胞生长的抑制作用观察

1.2.1 ApoG2、PTX 干预及半数抑制浓度(IC50)、细胞抑制率测定 取对数生长期CNE-2细胞，计数为8×104个/mL，取每孔100 μL接种于96孔培养板，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，待24 h细胞贴壁后加入含不同药物的培养液干预。①ApoG2干预:加入含ApoG2完全培养液200 μL，ApoG2浓度分别为为 5、10、20、40、60 μmol/L;②PTX 干预:加入含PTX 的完全培养液 200 μL，浓度分别为 0.001、0.01、0.1、1、2 μmol/L;③ApoG2 及 PTX 联合干预:加入含ApoG2及PTX的完全培养液200 μL，两药浓度不变。对照孔不加细胞悬液只加含0.1%DMSO培养液200 μL。加药后每个浓度设3个复孔，继续放入培养箱中培养。48 h后终止培养，每孔加入MTT20 μL(5 mg/mL)培养4 h，离心吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO震荡10 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪检测490 nm波长处吸光度值(OD值)。计算48 h的IC50、细胞抑制率及两药相互作用系数(CDI)。

1.2.2 ApoG2、PTX干预及细胞凋亡率检测 取对数生长期CNE-2细胞消化传代，待细胞长至70%满度时，吸弃旧培养液分为四组。对照组不干预;ApoG2 组予 ApoG2 20 μmol/L，PTX 组予 PTX 0.01 μmol/L，联合组予 ApoG2及 PTX，药物浓度同

1.2.1 。干预后继续培养48 h，取5 ×105个细胞，常规低速离心5 min，弃上清液加入400 μL的Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL的 Annexin V-FITC混匀，加入5 μL碘化丙啶(PI)混匀，室温条件下避光反应10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3 ApoG2、PTX对CNE-2细胞皮下移植瘤的抑瘤作用观察

1.3.1 皮下移植瘤模型建立及ApoG2、PTX干预取于H-DMEM培养基中培养的对数生长期CNE-2细胞制备细胞悬液。于12只Balb/c-nu裸鼠右背部皮下各接种5×105个CNE-2细胞(约0.1 mL)。待肉眼可见局部肿瘤生长时将小鼠随机分为四组(各3只)腹腔给药:对照组注射生理盐水;PTX组注射PTX 20 mg/kg(0.2 mL)，隔日 1 次，共3 次;ApoG2组注射ApoG2 80 mg/kg(0.2mL)，共5次;联合组联合应用ApoG2及PTX，给药剂量、方式及时间同单药组。

1.3.2 观察项目 ①肿瘤抑制率:待对照组肿瘤体积超过1 cm3(给药15 d左右)时处理小鼠，完整剥离皮下瘤结节，称重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(对照组瘤重－实验组瘤重)/对照组瘤重。绘制移植瘤生长曲线。②肿瘤组织Bcl-2蛋白表达:取各组移植瘤标本，石蜡包埋，4 μm切片。常规二甲苯脱腊，梯度酒精水化后置于枸橼酸缓冲液中微波加热至92～98℃，2 min后改为小火10 min以修复抗原，自然冷却至室温，按SP试剂盒说明书完成免疫染色各步骤，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:每组选取3张切片进行分析。Bcl-2阳性表达为肿瘤细胞胞质染成棕黄色。高倍镜(400×)下观察10个高倍视野，计数1 000个细胞，计算阳性细胞百分率。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件行统计学处理。数据以¯x±s表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较应用单因素方差分析(Oneway ANOVA)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长抑制情况

2.1.1 细胞抑制率 ApoG2、PTX单用及联用48 h细胞抑制率见表1。由表1可见，ApoG2、PTX单用对细胞生长均有抑制作用，与对照组比较，FApoG2=601.523，PApoG2=0.000;FPTX=482.730，PPTX=0.000;联合组抑制率随两药浓度增强逐渐增加，两者之间存在交互效应(F=12.590，P=0.000)，CDI＜1，两者发挥协同效应。作用48 h后ApoG2与PTX的IC50值分别为 45.41 μmol/L 和 0.13 μmol/L。

表1 ApoG2、PTX单用及联用48 h CNE-2细胞抑制率(n=3，%，¯x±s)

2.1.2 细胞凋亡率 20 μmol/L APoG2、0.01 μmol/L PTX及二者联用48 h细胞凋亡率分别为:对照组(2.17 ±0.32)%，APoG2 组(4.39 ±0.30)%，PTX 组(18.81 ±1.32)%，联合组(24.13±1.56)%。联合组明显高于单药组，P＜0.05。提示ApoG2与PTX联用较各单药应用能更明显诱导CNE-2细胞凋亡。

2.2 移植瘤生长抑制情况 皮下接种鼻咽癌CNE-2细胞4 d后肉眼可见局部肿瘤生长。

2.2.1 移植瘤生长情况 各组移植瘤生长曲线见图1。对照组、PTX组、ApoG2组、联合组治疗初期肿瘤均逐渐增大.但对照组生长速度在各时间点上均快于3个治疗组。从第5天开始各治疗组和对照组相比，肿瘤体积的变化差异有显著性(P＜0.01)。

图1 各组移植瘤生长情况

2.2.2 瘤重及抑瘤率 治疗结束后各组平均瘤重及抑瘤率比较见表2。

表2 治疗结束四组平均瘤重及抑瘤率比较(n=3，¯x±s)

2.2.3 肿瘤组织Bcl-2蛋白表达 Bcl-2表达率对照组为(91.29±3.61)%，ApoG2组为(67.12 ±4.57)%，PTX 组为(50.62 ±2.80)%，联合组为(31.54±6.02)%;与对照组比较，PTX 组、ApoG2组和联合组表达率均明显降低，P＜0.01;联合组显著低于PTX组和ApoG2组，P均＜0.01。

3 讨论

研究证实，ApoG2是Bcl-2的小分子阻断剂，能够诱导多种细胞凋亡［3，4］。PTX是目前已经明确的作用于细胞微管的抗肿瘤药物［5］，其通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂，而对正常的细胞基本无影响，是目前治疗鼻咽癌的重要化疗药物之一［6］。近年研究发现，微管的完整性被破坏后可导致Bcl蛋白磷酸化，促使细胞发生凋亡;Bcl-2磷酸化可抑制Bcl-2与Bax二聚体的形成，抑制Bcl-2的功能［7］。

线粒体依赖性细胞凋亡通路是指调节线粒体膜表面Bcl-2家族蛋白的表达，引起细胞色素C(Cytc)从线粒体内膜释放.促进凋亡体(由Cyt-c、Apaf和Caspase-9)的形成，进一步活化效应性的Caspase，从而调控细胞凋亡。高表达的抗凋亡的Bcl-XL和Bcl-2蛋白可以与线粒体外膜VDAC(电压依赖经的离子通道)结合，保护线粒体膜的完整性，当ApoG2结合抗凋亡蛋白并抑制其保护功能后，线粒体膜的完整性很快就被破坏;Bcl-2和Bcl-XL蛋白过表达均会抑制线粒体依赖性细胞凋亡通路，且会增加细胞对放化疗的抵抗性。Arnold等［8］研究表明，ApoG2能抑制淋巴瘤细胞增殖，诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞质，促进凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9活化，最终诱导淋巴瘤细胞发生凋亡。

Bcl-2是迄今为止功能最明确的细胞凋亡拮抗基因，其广泛分布于细胞膜系统(特别是在线粒体膜上)，有阻止细胞色素C释放、抑制细胞凋亡的作用。抗凋亡的Bcl-2家族蛋白在抑制肿瘤细胞凋亡中起着关键作用，这类蛋白在许多类型的肿瘤中均呈高表达，如鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌和肺癌［9，10］。鉴于其可能与肿瘤的放疗抵抗、化疗耐药以及不良预后相关，抑制Bcl-2活性或降低Bcl-2的表达水平可能成为鼻咽癌治疗的一条新途径。

本研究结果显示，ApoG2与PTX单药对细胞的抑制作用随药物浓度提高而增强，呈浓度依赖性，二者联合应用有协同作用;PTX与ApoG2联用的凋亡率高于单药应用，但总体凋亡率并不高，原因可能是部分凋亡晚期细胞已碎裂成碎片，与坏死无法区别;细胞凋亡早期细胞内结构已发生变化，但细胞膜完整，染料无法进入细胞内以及结合外翻的细胞膜进行染色。本研究结果显示，ApoG2、PTX及两者联用均可抑制移植瘤生长，随着作用时间的延长抑制作用更加明显，此与前期研究及国外文献报道相符［11，12］;从第 5 天起至治疗结束，联合组肿瘤生长抑制率均明显高于ApoG2组及PTX组，显示ApoG2及PTX有明显的协同作用，ApoG2可增强PTX的敏感性。为进一步探讨这种联合效应是否可特异性抑制靶蛋白的表达，我们采用免疫组化法检测了移植瘤组织Bcl-2蛋白的表达情况，结果提示PTX与ApoG2联用可协同抑制Bcl-2蛋白表达。

综上所述，ApoG2具有抗鼻咽癌及化疗增敏作用，且无明显毒副反应，可能是一种良好的治疗鼻咽癌的新药。

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