天麻素治疗帕金森病大鼠的实验研究

王维扬 黄怀宇

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是常见于中老年人神经系统变性疾病［1］。左旋多巴(L-dopar)替代治疗是公认的最常用、最有效、最基础的治疗药物［2］，但其不良反应不容忽视，中医药治疗PD 是我国临床医学的一大特色。本研究旨在探讨天麻素治疗PD 大鼠的实验性研究，为天麻素用于PD 患者临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 60 只健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(体质量180 ～200 g，2 ～3 月龄，南通大学实验动物中心提供)。6-羟多巴胺(6-OHDA)、阿朴吗啡(APO)、抗坏血酸购自美国Sigma 公司。小鼠抗酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体购自美国Chemicon 公司。荧光标记羊抗小鼠IgG 二抗购自美国Invitrogen 公司。天麻素注射液由上海现代哈森有限公司提供，左旋多巴购买于上海罗氏制药公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备与分组:2%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠颅平位固定于江弯I 型C 脑立体定向仪上，调上门齿钩平面，比耳间线平面低2 ～4 mm，使前囟与后囟保持在同一平面，定位于右侧中脑脑腹侧被盖区(VTA)区，破坏黑质纹状体束［3］。向定位点缓慢注入4 μl 6-OHDA，骨腊封闭颅骨孔并缝合头皮，术后大鼠置于25 ℃温室中直至清醒后置笼喂养。造模后第14 天腹腔注射APO 0.5 mg/kg 诱发旋转行为，采用钟式测转仪测量旋转次数，注射15 min后开始记录，共记录30 min，平均转速＞7 r/min 视为成功PD 大鼠模型［4］。选取造模成功的PD 模型大鼠40 只，随机分为4 组，每组10 只。对照组生理盐水5 ml/kg，腹腔注射;左旋多巴组7.8 mg/kg，皮下注射;天麻素组0.2 g/kg，腹腔注射;联合处理组天麻素0.2 g/kg，腹腔注射加用左旋多巴7.8 mg/kg，皮下注射，以上用药每天1 次，持续给药14 d，观察行为学后处死，取大鼠脑标本。

1.2.2 病理标本的留取:用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，打开大鼠胸腔，暴露心脏，经左心室向升主动脉灌注生理盐水300 ml，继之用4%多聚甲醛450 ml 灌注，之后断头取脑。将大鼠脑组织置于4%多聚甲醛，4 ℃放置4 h，再移入30%蔗糖缓冲液中24 h，待组织块沉底，固定后的中脑黑质部位用冰冻切片机切片，片厚15 μm。

1.2.3 免疫组织化学检测:用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗涤脑片5 min×3 次，将切片放到8%羊血清中，4 ℃过夜保存，弃去8% 羊血清，加入抗体工作液(1 ∶600 TH)4 ℃，3 d 后将鼠脑加入荧光标记二抗工作液中(TH 染色加入羊抗鼠二抗)4 ℃，2 d 后用50%甘油封片，用荧光显微镜成像系统拍照。

1.3 统计学分析 在200 倍显微镜下计数各组标本两侧黑质致密部的TH 阳性细胞数，同一鼠脑同侧三张累加计数值。所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS 17.0 统计软件包进行统计学处理，采用成组设计的单因素方差分析，组间两两比较采用q 检验，P ＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 天麻素对PD 大鼠行为的影响 治疗前各组PD大鼠每分钟旋转圈数比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。治疗后3 个治疗组与对照组比较PD 大鼠旋转圈数均减少，差异均有统计学意义(P ＜0.05);天麻素组与左旋多巴组PD 大鼠比较，差异无统计学意义(P ＞0.05);联合处理组较左旋多巴组旋转圈数减少，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

表1 注射APO 后大鼠每分钟旋转圈数的比较(±s，圈，n=10)

表1 注射APO 后大鼠每分钟旋转圈数的比较(±s，圈，n=10)

注:与对照组比较，* P ＜0.05;与左旋多巴组比较，△P ＜0.05

组别治疗前治疗后11.52 ±2.2410.78 ±2.37左旋多巴组12.03 ±2.818.30 ±1.71*天麻素组10.49 ±2.637.82 ±1.54*联合处理组11.71 ±3.076.21 ±1.02对照组＊△

2.2 天麻素对PD 大鼠VTA 区TH 阳性神经元的影响 对照组左侧VTA 区的TH 阳性神经元未见丢失，对照组右侧VTA 区的TH 阳性神经元数量比左侧减少，差异有统计学意义(P ＜0.05);天麻素组及联合处理组与对照组右侧比较TH 阳性神经元数量明显增加，差异有统计学意义(P ＜0.05);联合处理组与左旋多巴组比较TH 阳性神经元数量显著增加，差异有统计学意义(P ＜0.05);与天麻素组比较，联合处理组TH 阳性神经元数量差异无统计学意义(P ＞0.05)。天麻素及左旋多巴对PD 大鼠VTA 区TH 阳性神经元表达量的影响。见表2。

表2 各组大鼠脑组织VTA 区TH

3 讨论

在大鼠的行为学评价方面，APO 诱发的旋转实验是目前认为比较客观的主要评价指标［5］。多巴胺D2受体主要存在于DA 能神经元的突触后膜，当PD 动物模型损毁侧DA 能神经元减少时，在受体调节机制作用下，损毁同侧的D2受体相应上调，引起去神经超敏现象。APO 是一种D2受体激动剂，当损毁侧黑质-纹状体区DA 能神经元破坏超过70%时，动物会出现动作迟缓、僵硬少动等症状，而当出现APO 诱导性旋转时，则表明毁损侧破坏的DA 能神经元数量已经＞90%［6］。本研究显示6-OHDA 大鼠PD 模型毁损术后2 周，APO 诱发的旋转平均速度达11.44 r/min。本实验结果显示天麻素和左旋多巴均能显著降低大鼠的旋转圈数，而两者联合用药能使作用加强。

DA 的缺乏是PD 发病的发生基础，DA 合成的限速酶TH 在PD 的发病中起重要作用。大量研究证实，PD 动物模型及PD 病人体内TH 基因、酶蛋白含量及分布等存在广泛的异常改变［7］。本研究显示，6-OHDA 大鼠PD 模型各组中脑VTA 区TH 阳性神经元表达数量显著减少。说明存在DA 能神经元大量脱失，经黑质-纹状体通路投射到纹状体的DA 能神经递质显著减少，从而导致大鼠DA 和乙酰胆碱(Ach)系统失衡而产生行为学障碍，而予以天麻素等治疗后，各治疗组VTA 区TH 阳性神经元的数量明显增加，与对照组比较，各治疗组黑质区TH 神经元的变性、退化及坏死程度较轻，天麻素组及联合处理组较左旋多巴组改善更明显。表明中药天麻素能增加PD 大鼠VTA 区TH 的表达，减少DA 神经元损害的数量及程度，从而保护DA 神经元，减少PD 大鼠旋转圈数。TH 染色结果，进一步形态学方面证实天麻素可有效保护神经组织免受6-OHDA 引起的神经毒性损伤所造成的损害，从而为PD 的防治提供形态学依据。

PD 最主要的病变是黑质变性，由于黑质变性导致其致密部不能合成DA 输送至纹状体，使纹状体抑制性的DA 与兴奋性Ach 的功能失衡而发病。所以在临床上，一旦明确诊断PD 后，病人应长期服药［8］。目前，无论是使用抗胆碱能药物，还是DA 替代疗法，长期治疗后疗效减退，症状波动，并有神经毒性等不良反应。本研究赞同黄怀宇等［9］的观点，采用中药如天麻、丹参等制剂联合治疗，不仅能减少美多巴等药物的用量，疗效持久，不良反应小，而且天麻、丹参等中药制剂能够补肾益气，抗自由基，可以减轻PD 的病理损害，减轻PD 的症状。选择中医药联合治疗PD 不失为临床上的一个有益尝试，值得进一步研究。

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［2］ Fahn S. A new look at levodopa based on the ELLDOPA study［J］. J Neural Transm Suppl，2006(70):419-426.

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［4］ Paxinos G，Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates ［M］. 2nd ed. USA，San Diego:Academic Press，1998:36-37.

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［8］ 刘道宽.帕金森病的药物治疗［J］.实用老年医学，2001，15(6):289-292.

［9］ 黄怀宇，赵晓晖，黄志东，等.抗帕颗粒对帕金森病鼠模型旋转行为的影响［J］.实用老年医学，2004，18(2):81-83.