姜黄素对局灶脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及对新生神经细胞增殖的影响

刘双，程建华，韩钊，杨金龙，程朝晖，候圣陶

（1.温州医学院附属第一医院 脑血管科，浙江 温州 325000；2.加拿大国家科学院生物科学研究所，渥太华）

姜黄素是姜科姜黄属植物的根茎（中医又称莪术）的主要成分。早期研究表明姜黄素具有抗氧化、抗血脑屏障损伤和抗凋亡作用[1-3]，因此，推测姜黄素对于脑缺血损伤可能具有一定的保护作用。2008年，Kim等[4]在体外实验的研究中发现，姜黄素通过ERK和P38MAK介导机制能促进神经元再生，但姜黄素对在体的神经干细胞增殖是否有影响鲜有相关文献报道。5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU）是胸腺嘧啶核苷的类似物，能选择性地掺入到处于细胞周期S期（DNA合成期）细胞的单链DNA核苷酸序列中，BrdU免疫组化染色在神经生物学中成为研究神经干细胞增殖作用的重要方法。本研究采用连续腹腔给药的方法观察姜黄素对脑缺血再灌注损伤的保护作用，以及用BrdU免疫组化染色观察姜黄素对脑缺血后新生神经细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 激光共聚焦显微镜（日本，Olympus FV1000）；图像分析软件（Image J）；姜黄素、BrdU、玉米油及TTC（美国，Sigma公司）；绵羊抗大鼠BrdU一抗（美国，Abcam公司）；TRITC荧光二抗（美国，Jackson ImmunoResearch）；线栓（北京沙龙生物技术有限公司）

1.2 实验动物及分组 40只健康雄性大鼠，体质量250～280 g，平均（270±10）g，由温州医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0005。将大鼠随机分为空白对照组（n=10），假手术组（n=10），模型对照组（n=10），姜黄素给药组（n=10），大鼠于手术前自由饮水、饮食5 d，保持饲养环境安静，以日光采光，明暗周期各12 h，保持室温在18～22 ℃之间。大鼠在缺血再灌注损伤后1 h立即给予腹腔注射用药：姜黄素给药组给予姜黄素注射，其注射剂量为300 mg/kg，其余各组给予等剂量的注射用玉米油，用于免疫荧光检测的各组大鼠在处死前3 d每天按照50 mg/kg的剂量给予BrdU腹腔注射给药，每天两次。

1.3 大鼠MCAO模型制作 参照Zea Longa线栓法[5]再加以改进，以左侧大脑栓塞为例。大鼠术前禁食12 h，自由饮水。实验前腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉和迷走神经。颈总动脉打一活结，在颈外动脉离心端1 cm处结扎颈外动脉，同时夹闭颈内动脉，然后在颈外动脉上切一小切口，将线栓插入后剪短颈外动脉，之后将线栓沿着颈内动脉入颅的方向插入，当插入约距颈总动脉分叉处18～20 mm左右时感到一轻微阻力时便立即停止插入，即表明已经阻塞住大脑中动脉。阻断120 min后，将线栓拔出，解除颈总动脉活结，贯通颈总动脉与颈内动脉通路。完成脑缺血再灌注损伤的模型。假手术组将线栓插入10 mm，其余均与上述手术步骤相同。

模型成功评价指标：①右侧肢体疼痛回缩迟钝或消失；②提尾倒悬时右上肢向胸前屈曲；③行走时向右侧倾倒或转圈；④左侧出现Horner’s征。

1.4 神经行为学测定 参照Longa 5级4分法，神经功能评分采用单盲法，在动物模型制作后的24 h进行神经功能评分。0分：无神经功能缺损；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：向瘫痪侧转圈；3分：向病灶对侧倾倒；4分：不能自行行走，意识丧失。其中0分和4分者剔除试验，1～3分者纳入实验范围。

1.5 标本采集 连续给药7 d后，每组各5只大鼠10%水合氯醛麻醉后，迅速断头取脑，放于-20 ℃冰箱2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色备用。各组剩余大鼠经过心脏10%氯化钠溶液灌注后放于4%的多聚甲醛中4 ℃固定12 h后常规脱水、透明、浸蜡后，连续4μm的冠状切片，用于后续的免疫荧光的检测。

1.6 脑梗死体积的测定 从-20 ℃中取出脑组织，间隔2 mm连续行5个的冠状切片，将组织切片置于TTC磷酸盐缓冲液中，37 ℃避光、恒温孵育15 min，梗死灶染成白色，正常组织染成红色，数码相机拍照，应用Image J软件对图像进行处理，计算出梗死灶面积，按公式：V=（A1+A2+……+An）t-（A1+An）t/2计算脑梗死体积，其中t为切片厚度，A为梗死面积[6]。

1.7 免疫荧光检测BrdU的表达 做厚度为4μm的切片，利用免疫荧光的检测方法检测大脑梗死侧侧脑室下区的BrdU的表达。首先，石蜡切片脱蜡水化：在二甲苯中脱蜡30 min后放入梯度酒精中水化。其次，枸橼酸高压抗原修复3 min，自然降至室温。PBS冲洗后将切片置于2 mol/L的HCl中冰上孵育10 min，室温下孵育10 min，37 ℃下孵育20 min后直接置于0.1 mol/L的硼酸中中和10 min。最后，PBS冲洗后滴加BrdU一抗（1:50），室温孵育1 h后4 ℃孵育过夜，16 h后滴加四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记的荧光二抗，室温下放置30 min后利用激光共聚焦显微镜观察，拍照。阴性对照采用PBS代替一抗的孵育，其他步骤与上述步骤相同。

1.8 统计学处理方法 采用SPSS 16.0进行统计学分析。全部数据以±s表示，单因素方差分析采用one-way ANOVA，方差齐性组间两两比较采用LSD检验，方差不齐组间比较采用Dunnett’s T3法检验。检验标准为α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 局灶性缺血再灌注损伤24 h后，大鼠有不同程度的神经功能缺损，模型对照组的症状较为严重，而空白对照组及假手术组没有症状出现。姜黄素给药组神经功能评分与模型对照组相比差异无统计学意义，但呈现下降趋势（见图1）。

图1 姜黄素给药组和模型对照组的神经功能评分

2.2 脑梗死体积测定 空白对照组与假手术组未见梗死灶，模型对照组与姜黄素给药组出现不同程度的梗死灶，其中给药组的梗死灶体积小于模型组的梗死灶体积，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）（见表1）。

表1 四组脑梗死体积测定和BrdU阳性细胞数（n=10，±s）

表1 四组脑梗死体积测定和BrdU阳性细胞数（n=10，±s）

与模型对照组比：aP＜0.01

组别空白对照组假手术组模型对照组姜黄素给药组梗死体积测定（mm3）00 155.6±11.26 67.8±11.05a BrdU阳性细胞数（个）5.1±1.21 6.2±3.12 21.0±5.23 50.6±12.60a

2.3 BrdU免疫荧光 BrdU阳性细胞为红色荧光TRITC标记的细胞，阳性细胞主要出现在梗死灶的周围。空白对照组和假手术组仅有少量的阳性细胞出现，而模型对照组和姜黄素给药组有大量的阳性细胞出现。同模型对照组相比，姜黄素给药组的阳性细胞表达量更多，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）（见表1，图2）。

图2 侧脑室下区Brdu阳性细胞的表达（×400）

3 讨论

本研究发现，在局灶性脑缺血再灌注损伤后1 h，给予姜黄素腹腔注射治疗后能够显著减小给药组的脑梗死体积，并能增加缺血侧侧脑室下区的新生神经细胞表达。因此，本实验结果表明姜黄素对局灶性脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，并能促进缺血区侧脑室下区的神经细胞再生。

脑保护剂的研究作为神经生物的一大研究热点、难点，越来越受到研究者的关注，但众多应用于临床上的脑保护剂并未再现其在实验研究阶段的脑保护效果。因此，在研究姜黄素的脑保护作用时，我们采用更符合临床用药规律的给药方式，将姜黄素的给药持续时间延续到7 d，采用神经功能学评分以及TTC染色来确定姜黄素连续腹腔注射7 d的脑保护作用效果。从TTC染色的结果我们可以看出，空白对照组、假手术的大鼠未见任何梗死灶，而模型对照组梗死灶体积较大，同模型对照组相比，姜黄素给药组的梗死灶体积明显减小，差异具有统计学意义。因此，我们推断姜黄素在脑缺血再灌注损伤后具有神经保护作用。从神经功能学评分上我们可以看出空白对照组、假手术组的SD大鼠神经功能完全正常，姜黄素给药组的神经功能评分同模型对照组相比差异不具有统计学意义，但亦呈现下降的趋势，表明神经缺损症状有所改善，神经功能有所恢复。评分结果差异不具有统计学意义的原因我们分析：Longa 4分制的神经功能评分具有一定的局限性，其评分要素仅仅局限于运动功能的改变，而对于感觉功能，反射能力等变化并未涉及，因此不能完全说明脑缺血损伤后的神经功能恢复情况。这也提示我们在临床上的神经功能恢复的判断，采用综合的判断方式才更为精确。

BrdU，作为神经新生细胞有丝分裂的主要标记物之一[7]，已经被广泛运用于神经生物学的研究当中。BrdU是DNA中胸腺嘧啶的类似物，在DNA合成的S期插入到细胞周期当中，所以一旦新生细胞进行此步合成，研究者就可以运用免疫学等方法检测到新生细胞的表达[8]。因此，我们采用BrdU作为新生神经细胞的标记物进行检测。从实验结果我们可以看出成年SD大鼠在未受任何刺激的情况下存在神经再生的现象，这也间接证实了2000年Gage[9]阐述的哺乳类动物在整个成年期都存在神经新生的推断。从模型对照组我们也可以看出脑缺血再灌注损伤的有效刺激后SD大鼠的神经再生数目显著增多，同空白对照组和假手术组相比差异具有统计学意义，而姜黄素给药组同模型对照组相比数量更多，其差异具有统计学意义。以上结果提示我们姜黄素能够促进局灶性脑缺血再灌注损伤后的神经再生，有可能是姜黄素的脑保护作用的机制之一。但姜黄素与神经再生的研究还比较粗浅，在本实验中我们测定了BrdU标记的新生神经细胞情况，但新生的神经细胞其迁移、分化情况还需要进一步的研究，故对于新生神经细胞我们还应采用更多的标记方式标记它的成熟、分化程度，同时观察其迁移趋势，以便证实这些新生细胞是否真正发挥其功能，对脑缺血损伤是否具有修复功能。同时，神经新生的部位主要发生在两个区域，侧脑室下区（SVZ区）和齿状回下区（DG区）[10]，因此在今后的研究当中我们需要对两个部位同时进行观察，以便得出更精确的结论。

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