CDKAL1基因rs7756992位点多态性与2型糖尿病发病风险及临床特征关联分析

李伟，牛庆，李霞莲，沈飞霞，施红英，曹淑彦，张婷，李春梅，吕建新

（温州医学院，浙江 温州 325035，1.检验医学院、生命科学学院 检验医学教育部重点实验室；2.附属第一医院 内分泌科；3.环境与公共卫生学院；4.附属第二医院 科研中心）

据国际糖尿病联合会数据显示，2011年全球约有3.66亿糖尿病患者，预计到2030年将增长到5.52亿[1]，其中2型糖尿病（T2DM）占90%～95%。2007年6月至2008年5月，在中国成年人中进行的一次大规模调研显示，T2DM和糖耐量异常人数分别约为9240万和1.48亿，且以中青年人为主，居世界第一位[2]。因此，对T2DM防治已是刻不容缓。T2DM是由胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能失调引起的一种多基因遗传性疾病，遗传因素和生活环境因素相互作用被公认为是该病形成的主要机制。因此，易感人群的筛查和早期生活方式的干预是预防T2DM发生发展的有效措施。

从2007年迄今，通过采用全基因组关联分析（genome wide association study，GWAS）技术，已报道约40个基因与T2DM密切相关[3]，其中包括CDKAL1（CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1）。该基因在不同种族和人群中得到反复验证，是公认的易感基因之一[4]，位于人类染色体6p22.3，可以编码一种tRNA修饰酶-甲硫基转移酶，主要负责tRNALys（UUU）37位碱基的2-甲硫基-N6-苏氨酸氨基甲酰腺苷酸（2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine，ms2t6A）合成[5]。在β细胞特异性CDKAL1基因敲除小鼠中，发现胰岛β细胞线粒体ATP生成障碍和第一时相胰岛素分泌受损[6]。2007年冰岛人群的GWAS研究首次报道了rs7756992位点与T2DM关联[7]，后来在多个研究中，特别是在亚洲人群中得到重复验证[8]。因此，该基因多态性位点的基因型分析在确定T2DM易感人群中具有重要意义。

由于T2DM遗传的高度异质性，在不同民族和不同人群中易感基因的检测及其作用仍需要进行重复验证。本研究采用高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）和DNA测序技术，建立基因分型的技术平台，对rs7756992位点与中国汉族人群T2DM的关联性进行验证，并进一步分析不同基因型的临床特征，为该病分子分型建立初步基础。

1 材料和方法

1.1 研究对象 病例组来自温州医学院附属第一医院内分泌科住院部2009年3月至2010年10月期间被诊断为T2DM的患者，共534例；对照组人群由2009年12月至2010年1月期间于温州市体检中心进行体检的健康体检者筛选所得，共453例，所有入选者均为浙江省温州地区汉族人群。T2DM诊断根据1997年WHO糖尿病诊断标准，且排除：①其他内分泌及代谢性疾病患者，如甲状腺功能亢进和减低、原发性醛固酮增多症等；②恶性肿瘤和非高血压引起的严重心、肝、肾等慢性疾病患者；③药物等因素引起的糖、脂代谢异常者；④风湿免疫性疾病患者；⑤不合作或资料不全者。对照组人群的筛选标准为：空腹血糖（FBG）＜5.6 mmol/L的非糖尿病体检者，且既往无糖尿病病史及家族史。该研究经温州医学院附属第一医院伦理委员会批准，调查和取样均征得受试者本人同意并签署知情同意书。

1.2 生化指标测定与样本DNA提取 所有研究对象采集空腹外周静脉血2 mL，用于基因组DNA提取及各项生化指标测定。使用DNA提取试剂盒（大连宝生物有限公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，D824A）及磁珠提取法（深圳易瑞生物技术有限公司的800μL全血基因组DNA磁珠提取试剂盒）对收集的病例组和对照组样本进行全基因组DNA提取，用NanoDrop 2000分光光度计测定其浓度和纯度后，保存在-30 ℃冰箱中。

1.3 HRM基因型分类

1.3.1 引物：HRM对引物自身结构和特异性要求较高，PCR扩增长度以60～150 bp最佳，且扩增片段越短，基因型分类越容易。本实验所采用的引物由Primer 5设计，并由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物上游序列为5’-CCATTAATATTC CCCCCTGT-3’，下游序列为5’-GAGCTTCATGCAACCAAG AG-3’，扩增片段长度124 bp。

1.3.2 PCR扩增和HRM条件：使用Light Cycler 480 SystemII（德国罗氏公司）对所有样本全基因组DNA进行PCR扩增和HRM分析，实验所用试剂LightCycle480 High Resolution Melting Master购自罗氏公司。

首先使用设计好的HRM专用引物做普通PCR，获得引物的最佳退火温度。然后随机选取5～10个样本进行HRM分析，得到最优标准化温度（71～72 ℃和80～81 ℃），并根据熔解曲线形状和颜色区分样本基因型。

本实验在96孔板中进行。HRM优化后的扩增体系为：HRM Master 5μL， MgCl21μL（2.5 mmol/L），上下游引物各0.5μL（0.5μmol/L），全基因组DNA 1μL（约10～25 ng）和一定量的去离子水（调节最终反应体积至10μL）。HRM反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，最后72 ℃延伸15 s，共45个循环。PCR扩增结束，产物于95 ℃加热1 min后降至40 ℃，然后又以1℃/s的速度从65 ℃加热至95 ℃，最后在40 ℃条件下冷却10 s。实验结果可视化荧光数据有标准图、温度变化图和差异图三种，使用LightCycle480 Gene scanning软件自动化分组功能进行分析。

1.3.3 假阳性和假阴性结果排除：由于HRM技术会出现假阳性和假阴性结果，我们设阳性对照和阴性对照。另外对一些结果不可信的样本进行重复上机，并随机抽取各20例病例组和对照组样本用DNA直接测序技术进行验证。

1.4 DNA直接测序 DNA测序技术可以对变异进行定位和鉴定，是目前基因分型技术中检测基因突变和单核苷酸多态性的金标准。本研究通过该技术，测定HRM熔解曲线中不同颜色和形状的曲线所代表的基因型，并对随机抽取的少量样本进行验证。我们通过PCR技术扩增CDKAL1基因中包含rs7756992位点的DNA片段，扩增片段经过纯化后直接用于测序分析。PCR扩增用引物，上游为5’-TCTGATTTTCTCA CCCTACAC-3’，下游为5’-CCTGGGAGAATTTACTTGG-3’，由Primer 5设计，北京六合华大基因科技股份有限公司合成。PCR扩增体系（25μL）包括：去离子水18μL，dNTP 2μL，Buffer 2μL，MgCl21.5μL，上下游引物各0.2μL（10μmol/L），Taq酶0.1μL（大连宝生物公司Takara PCR反应体系）。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，其中变性、退火和延伸分别扩增35个循环，最后72 ℃延伸6 min。PCR产物的纯化和测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.5 统计学处理方法 临床资料分析中呈正态分布的计量资料用±s表示，使用独立样本t检验，非正态分布计量资料用中位数（四分位间距）表示，经变量变换转为正态后再做独立样本t检验，而变量变换后未转为正态的非正态分布资料用秩和检验，计数资料使用x2检验。群体基因型和等位基因频率均经Hardy-Weinberg平衡检验样本的群体代表性。rs7756992基因型和等位基因与T2DM发病风险和糖尿病并发症关联分析使用x2检验。T2DM患者不同基因型与临床特征比较，呈正态分布的计量资料用单因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA），非正态分布资料经对数变量变换转为正态后用ANOVA，计数资料用x2检验，然后对于有统计学意义的指标，使用多元线性回归进行校正。所有数据用SPSS 17.0软件包统计分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组和对照组的临床特征及生化指标比较 病例组和对照组临床资料及各项生化指标统计情况见表1。病例组人群年龄、BMI、血压、FBG和血清甘油三酯（TG）较对照组显著增高（P＜0.05），尤其是BMI、血压、FBG和TG差异更为明显（P＜0.01）。对照组人群血清总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）显著高于病例组（P＜0.01），而性别分布在两组人群中无明显差异（P＞0.05）。

表1 病例组和对照组人群临床基本特征（±s）

表1 病例组和对照组人群临床基本特征（±s）

注：*表示非正态分布资料，变量变换转为正态后使用独立样本t检验；#表示变量变换后未转为正态资料，使用秩和检验

临床特征例数年龄（年）性别（男/女）BMI（kg/m2）血压收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）TC（mmol/L）*TG（mmol/L）*HDL（mmol/L）*FBG（mmol/L）#534 61.03±12.65 280/254 24.25±3.38 453 58.82±11.39 229/222 22.31±2.19＜0.05＞0.05＜0.01 143.24±24.8 80.47±11.68 4.36（1.46）1.29（0.98）1.11（0.42）8.05（4.10）119.12±11.48 74.65±8.24 4.73（1.02）1.00（0.51）1.36（0.45）5.02（0.81）＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01 P病例组 对照组

2.2 基因型和等位基因检测及分析

2.2.1 HRM分析：图1A为rs7756992的标准熔解曲线，图1B为标准化的温度变化曲线，随着温度的改变，代表不同基因型的熔解曲线形状和颜色发生改变。其中绿色表示突变型GG，红色表示野生型AA，而蓝色则表示杂合子AG。

图1 高分辨率熔解曲线（HRM）

2.2.2 DNA直接测序结果分析：DNA测序结果使用Condon code Aligner软件与NCBI中提供的人类CDKAL1基因标准序列（GenBank#：NC_000006.11）进行比对分析，查找发生核苷酸变异的位点（见图2）。经验证，在随机抽取的40例样本中两种实验方法的重复率达到100%。

图2 rs7756992位点DNA测序结果

表2 rs7756992位点各基因型和等位基因频率分布

2.3 等位基因及基因型分析 病例-对照组人群进行Hardy Weinberg检验，多态性位点基因型及等位基因频率在病例组和对照组中均达到遗传平衡，具有群体代表性。

我们将CDKAL1基因rs7756992位点基因型频率分布按照G/A，GG/AA，（GG+AG）/AA，GG/（AG+AA）四种模型进行分析（见表2），可以看出：在病例组和对照组间，基因型GG所占比重较AA型大，两者比较差异有统计学意义（P＝0.048，OR=1.43，95%CI＝1.00～2.03），而且等位基因G对T2DM也存在一定影响（P＝0.045，OR=1.12，95% CI＝1.00～1.43）。

2.4 基因型与临床特征分析 按照不同基因型AA、AG和GG将T2DM患者分为三组，对每组的临床特征及生化指标进行比较。从表3中可以看出：GG基因型患者发病年龄较AA型低，三种基因型间差异有统计学意义（P＝0.02），但是经过性别和年龄校正后，差异不再有统计学意义；AA和AG基因型患者的FBG浓度较GG型增高，三者间有显著差异（P＝0.03），经过性别和年龄校正后，差异仍然显著（P＜0.01），但是三组之间HbA1c未见显著差异。另外，不同基因型患者之间血压、BMI和血脂差异无统计学意义，但通过对这3个参数按照临床标准进行等级划分后发现，在肥胖和TC异常患者中GG基因型所占比重最大。

2.5 等位基因及基因型与T2DM并发症关联分析 将534例T2DM患者按照糖尿病并发症类型进行分组（划分标准是根据临床诊断和相关辅助检查，如血管B超、视网膜检查、神经肌电图检查、肝肾功能检查和血压测量等），观察基因型和等位基因频率在各种慢性并发症中的分布。结果发现两者间无显著关联（见表4）。

3 讨论

2007 年，在冰岛人群的病例-对照研究中，首次发现rs7756992（G）与T2DM关联，而且这一结果在丹麦、欧洲祖先人群以及中国香港汉族人群中得到验证[7]。随后，在多项研究中也证实了这一位点与亚洲人群T2DM存在关联，G为风险等位基因（OR＝1.19）[8]。在最近的中国大陆汉族人群研究中，也已得到验证（OR＝1.21）[13]。在本研究中，我们进行了CDKAL1基因rs7756992位点与T2DM的关联分析，验证了在浙江省温州地区汉族人群中，rs7756992（G）为T2DM风险等位基因（P＝0.045），这一结果与文献报道相吻合，说明该位点与中国汉族人群T2DM紧密关联。同时，我们观察到GG基因型与AA基因型相比差异有统计学意义（P＝0.048），GG基因型在T2DM人群中频率增高，这一频率分布与文献[14]报道的数据基本一致。

表3 病例组不同基因型患者临床特征比较（±s）

表3 病例组不同基因型患者临床特征比较（±s）

注：*表示非正态分布资料；a表示用多元线性回归，经性别和年龄校正后；△BMI正常范围：18.5≤BMI＜24，过重：24≤BMI＜27，肥胖≥27；▲TC＞6.0 mmol/L为异常

P 0.28 0.06 0.02（0.88a）0.76 0.59 0.03（＜0.01a）0.71 0.69 0.11 0.37 0.84 0.38基因型例数（%）年龄（年）性别（男/女）BMI（kg/m2）△正常[例数（%）]过重肥胖血压收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）发病年龄（年）胰岛素治疗（有/无）家族史（有/无）FBG（mmol/L）*HbA1c（%）TC（mmol/L）*▲＞正常[例数（%）]TG（mmol/L）*HDL（mmol/L）*LDL（mmol/L）*AA 114（21.35）59.69±12.77 67/47 24.08±2.98 55（48.25）41（35.96）18（15.79）AG 260（47.88）62.28±13.00 131/129 24.02±3.48 127（49.22）84（32.56）47（18.22）143.76±24.71 81.31±11.64 51.26±13.01 60/54 47/67 8.00（4.03）9.46±2.68 4.29（1.37）10（8.77）1.21（0.94）1.11（0.37）2.71（1.12）GG 160（29.47）59.93±11.83 82/78 24.75±3.44 69（43.12）49（30.63）42（26.25）0.08 0.31 0.08 0.21 141.60±24.79 79.25±11.82 54.00±13.39 135/125 95/165 8.35（4.51）9.59±2.44 4.31（1.59）27（10.42）1.29（0.95）1.11（0.40）2.60（1.08）145.52±24.68 81.86±11.27 50.55±11.10 89/71 65/95 7.49（3.60）9.36±2.26 4.50（1.51）26（16.25）1.34（1.23）1.12（0.44）2.78（1.37）

表4 不同基因型T2DM患者糖尿病并发症比较

有研究证实，CDKAL1基因变异可以影响T2DM患者的临床特征，如HbA1c和胰岛素分泌[9-10]。同时，也与糖尿病风险因素BMI关联[11]。FBG、餐后血糖和HbA1c是我们常规监测血糖控制情况的三项指标，HbA1c反映的是2～3个月内血糖控制的平均水平。本研究中，我们对不同基因型T2DM患者间的临床特征进行了比较，发现GG基因型患者FBG较低，经过性别和年龄校正后差异更加显著（P＜0.01），但是HbA1c在不同基因型患者间并无显著差异，我们推测这种差异可能是受餐后血糖的影响。多项研究证实，CDKAL1风险等位基因可能会影响胰岛β细胞功能，使得第一时相胰岛素分泌受损[9]，这一点在基因敲除小鼠研究中也得到证实[6]。第一时相胰岛素分泌对降低餐后血糖有重要作用，它能迅速抑制内源性葡萄糖产生并抑制餐后血糖水平的升高，参与餐后高血糖的发生。因此，我们推测GG基因型患者的FBG偏低而HbA1c与其他基因型并无差异，可能是由餐后高血糖引起的，这还需要进一步研究。虽然，其他临床特征如血压、BMI和血脂等在各组间差异未见有统计学意义，但是经过对BMI和TC分级统计发现，T2DM患者中肥胖和TC偏高者在GG基因型中所占比重最大。最近研究报道，在东亚人群中CDKAL1基因多态性位点（rs9956744和rs2206734）会影响BMI[11]，欧洲人群中也有类似的研究结果[15]。因此，不能排除rs7756992位点与BMI的关联。

CDKAL1基因变异与T2DM并发症的关系鲜见大规模的研究报道。由于CDKAL1基因与一个糖尿病微血管病变候选基因VEGF紧密连锁[16]，最近国内也有研究报道该基因可能与糖尿病视网膜病变有关[12]，所以CDKAL1基因多态性位点是否与T2DM并发症关联值得进行探索性研究。但是在本研究中，通过我们的分析，未发现rs7756992位点与糖尿病的各种慢性并发症存在相关性。

本研究中我们进一步证实了在中国汉族人群中，CDKAL1基因rs7756992多态性可以增加T2DM的发病风险，且不能排除其与血糖调节机制相关，另外，我们没有发现该位点与糖尿病慢性并发症关联。因此，CDKAL1基因与T2DM的关系进一步得到验证，该位点等位基因和基因型的检测可以为T2DM发病风险和分型提供参考，利于疾病的早期诊断，值得进一步深入研究。

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